HPLC法測定非布索坦片的含量

北京萬生藥業有限責任公司（101113）辛正洪

非布索坦（febuxostat，Uloric）化學名為2-[3-氰基-4-異丁氧基苯基]-4-甲基噻唑-5-甲酸，是一種新型非嘌呤類選擇性黃嘌呤氧化酶抑制劑，用于降低體內的尿酸水平，治療由于尿酸過高引起的疾病。2009 年 2 月，FDA 批準了武田制藥北美公司的非布索坦。臨床療效表現顯著較別嘌呤醇好，可大幅度降低血尿酸水平，耐受性好且不良反應小，在治療高尿酸血癥及痛風上具有很大的應用前景[1]。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀及其色譜工作站，TU－1901PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm Kromasil公司)；BP211D電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）。非布索坦對照品（北京萬生藥業有限責任公司，原料藥精制，含量99.9%，HPLC歸一法），非布索坦片（北京萬生藥業有限責任公司自制，40mg，批號：20101201、20101202、20101203），乙腈、甲醇為色譜純，乙醇、甲酸、醋酸、磷酸鹽為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗 根據文獻報道非布索坦的性質[2][3]，經過甲醇、乙腈與水、磷酸鹽、醋酸鹽緩沖液的不同比例的篩選，最終選擇色譜條件為：色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm Kromasil公司)；流動相為乙腈－0.1%甲酸（55∶45）；檢測波長：317nm；流速：1ml?min-1；進樣量：10μl；柱溫：30℃。

測定法：精密稱取非布索坦對照品10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲使溶解，得對照品溶液。精密稱取非布索坦片細粉適量（約相當于非布索坦10mg），置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲使溶解，取續濾液為供試品溶液。分別量取兩種溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以非布索坦峰面積計算，即得。

在上述條件下，理論板數按非布索坦計為8231。

2.2 專屬性試驗

2.2.1 取單位制劑量（片）空白輔料，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲使溶解，得輔料樣品溶液。取續濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.2 取非布索坦片細粉適量（約相當于非布索坦40mg），5份分別置100ml量瓶中。4500LX條件下放置10天，用甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲使溶解，得光照破壞樣品溶液；120℃條件下放置2小時，取出、放冷至室溫，用甲醇溶解稀釋至刻度，超聲使溶解，得高溫破壞樣品溶液；加入1 mol?L-1氫氧化鈉溶液5ml，加蓋密封，于50℃水浴保溫0.5小時，加入1mol?L-1的鹽酸溶液5ml中和，用甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲使溶解，得強堿破壞樣品溶液；加入1 mol?L-1的鹽酸溶液5ml，加蓋密封，于50℃水浴保溫0.5小時，加入1 mol?L-1氫氧化鈉溶液5ml中和，用甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲使溶解，得強酸破壞樣品溶液；加入30%的雙氧水5ml，加蓋密封，于50℃水浴保溫0.5小時，用甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲使溶解，得強氧化劑破壞樣品溶液。分別取上述溶液濾過，取續濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結果顯示：空白輔料產生的雜質對樣品雜質測定無干擾，經光照、高溫、強堿、強酸、強氧化破壞后，樣品色譜圖與破壞前相比，都產生了新雜質，新雜質峰與主峰能完全分離。

2.3 線性試驗 精密稱取非布索坦對照品20mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，超聲溶解，為儲備液。精密量取0.5、1、2、3和5ml，分別置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述不同濃度溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度C為橫坐標,峰面積A為縱坐標進行線性回歸，方程：A=24.241C-1.3173（r=0.9996），見非布索坦濃度在20～400μg?ml-1間呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗 取非布索坦對照品溶液（100μg?ml-1）重復測定6次，記錄峰面積，RSD為0.68（n=6）。

2.5 重復性 精密稱取同批樣品(批號20101201) 6份，按供試品溶液的制備方法操作，分別進樣測定，結果非布索坦片平均含量為99.80%，RSD 為0.65% 。

2.6 回收率試驗 精密稱取非布索坦對照品8、10、12mg分別加至已知含量的非布索坦10mg中，每個濃度各配置3份，共9份，置200ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲使溶解，得低、中、高3種濃度的供試品；依法進樣測定，計算回收率。3個濃度樣品回收率分別為99.2%、99.8%和99.4%，RSD分別為056%、0.33%和0.40% 。

2.7 檢測限 逐級稀釋非布索坦對照品溶液，進樣10μl，按信噪比為3∶1計算，測得非布索坦檢出限為0.8ng。

2.8 穩定性試驗 取供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h后進樣測定，記錄峰面積，RSD 為0.89 %，表明供試品溶液在8h內穩定。

2.9 含量測定 取3批供試品溶液進樣測定，記錄色譜圖；另取對照品溶液同法測定，按外標法以峰面積計算樣品含量，結果3批樣品（批號為：20101201、20101202、20101203) 的含量分別為99.4%、100.1%和100.5%。

3 討論

非布索坦在乙醇、甲醇、乙腈中微溶，使用乙醇做溶劑時，雜質峰較大。最后選用溶解性能較好的甲醇作為溶劑。以乙腈－0.1%甲酸（55∶45）為流動相，其基線噪聲、分離度、穩定性良好。因217nm 波長基線噪聲大不易平衡，最后選用317nm為檢測波長。在317nm波長處，非布索坦片雜質也有較強吸收。在室溫時，非布索坦保留時間較長，將柱溫提高到30℃時，保留時間在15min內。本研究建立了一種靈敏、快速、準確地測定非布索坦含量的高效液相色譜方法。