不同缺血時段大鼠心肌組織中Nanog的表達變化及意義

(1新鄉醫學院第一附屬醫院，河南衛輝 453100;2新鄉醫學院基礎醫學院;3新鄉醫學院組織再生重點實驗室)

心肌缺血可導致心肌細胞缺氧，引起某些核轉錄因子的激活，影響干細胞分化。目前研究發現［1］，作為一種調節干細胞自我更新的核轉錄因子Nanog在心肌缺血的發病機制中的起重要作用。Nanog是一種存在于哺乳動物多潛能細胞和發育中的胚胎細胞中的同源結構域蛋白，它不僅對胚胎細胞的形成特別重要，而且對體細胞多潛能表達也起調節作用［2］。2009年8月～2010年3月，我們采用RT-PCR和Western blot法觀察急性心肌缺血損傷大鼠心肌組織中Nanog mRNA和蛋白表達變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理 選用健康SD雄性大鼠30只(河南省實驗動物中心提供)，體質量180～220 g。隨機分為假手術組(正常組)和Q1、Q2、Q3、Q4組，各6只。后四組采用冠狀動脈前降支結扎法建立心肌缺血模型［3］，以結扎后心前壁顏色變暗和ST段明顯抬高0.15 mV確定建模成功。正常組除不結扎冠狀動脈前降支外，余相同。

1.2 主要試劑 RT-PCR試劑盒，Nanog兔抗鼠多克隆抗體，辣根酶標記山羊抗兔IgG，PVDF膜(孔徑0.45 μm，ECL-Western blot試劑盒等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 各組心肌組織中Nanog mRNA及蛋白檢測

1.3.1 各組心肌組織中Nanog mRNA檢測 取正常組心肌組織，Q1、Q2、Q3、Q4組分別于心肌缺血2、6、12、24 h時取心肌組織，采用 RT-PCR 法檢測。先提取組織中的總RNA，逆轉錄合成cDNA，半定量RT-PCR擴增 Nanog、β-actin cDNA片斷。Nanog上下游引物序列分別為5'-ATGCCTGTGATTTGTGGGCC-3'、5'-GCCAGTTGTTTTTCTGCCAC-3'，β-actin上下游引物序列分別為5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'、 5'-GCTCAGGATCTTCATGAGGT-3'。PCR反應條件:95℃預變性3 min，94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃延伸5 min。予以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果拍照后用圖像分析灰度掃描，進行半定量分析。以Nanog與β-actin PCR產物條帶灰度值比值為Nanog mRNA相對表達量。

1.3.2 各組心肌組織中Nanog蛋白檢測 各組心肌組織提取同1.3.1。所有標本－78℃保存，采用Western blot法檢測各組心肌組織中Nanog蛋白。以β-actin為內參照。將蛋白印跡顯影圖像掃描，用Image J圖像分析軟件進行半定量分析，以Nanog蛋白灰度值與內參照 β-actin灰度值比值為Nanog蛋白相對灰度值(灰度值與蛋白表達量成反比)。

2 結果

2.1 各組心肌組織中Nanog mRNA表達結果 正常組和 Q1、Q2、Q3、Q4組心肌組織中 Nanog mRNA相對表達量分別為 0.14 ±0.04、0.15 ±0.04、0.51±0.07、0.34 ± 0.04、0.11 ± 0.04。以 Q2、Q3 組Nanog mRNA表達最高(P均＜0.05)。

2.2 各組心肌組織Nanog蛋白表達結果 正常組和Q1、Q2、Q3、Q4組心肌組織中Nanog蛋白相對灰度值分別為 3.46 ±0.37、2.59 ±0.09、2.14 ±0.98、2.44 ±0.31、3.53 ±0.55。以 Q2、Q3 組蛋白表達最高(P 均 ＜0.05)。

3 討論

有研究認為［4］，Nanog基因是“逆轉因”物質，可以把普通細胞轉變為胚胎細胞，再指導新細胞生長出人類需要的各種人體組織，來代替已失去功能的組織器官。最新研究表明［5］，Nanog與另兩個重要核轉錄因子Oct4、Sox2同位于細胞全能性調控網絡的頂端，是保持胚胎干細胞自我更新和多能性的中心物質，它們與多條信號轉導通路中的蛋白或轉錄因子構成龐大的調控網絡共同調節ES細胞的自我更新和全能性;同時通過調控在生物發育進程中起關鍵作用的可阻遏基因從而調節與分化有關的下游基因，調控生物的發育過程。

本實驗中，我們首先建立了急性心肌缺血模型，采用RT-PCR和Western blot方法從基因和蛋白水平對缺血心肌組織中Nanog進行研究。本研究結果顯示，正常組大鼠心肌組織中Nanog mRNA和蛋白呈微量表達，心肌缺血后2～12 h，心肌組織中Nanog mRNA和蛋白表達逐漸增加，以6～12 h增加顯著，12 h后有所下降，24 h時呈幾乎不表達，提示心肌缺血組織中Nanog表達明顯上調，其原因可能是心肌損傷后的修復反應，Nanog高表達有利于心肌細胞增殖［6，7］。目前有關Nanog蛋白的作用靶點尚不十分清楚。Nanog蛋白作為一種轉分化抑制因子，并不終止已定型的終末分化細胞，因此高度分化的心肌細胞，還可重新啟動Nanog基因，合成Nanog蛋白，調節和促進心肌細胞再進入分裂循環［8］。

所以我們推測Nanog是心肌缺血后心臟病理生理改變的重要因素之一。缺血心肌組織中Nanog表達變化，可能在缺血后心肌重構過程中有著重要的作用，至于其作用機制及對心功能的影響等尚待進一步研究。

［1］Li TS，Cheng K，Lee ST，et al.Cardiospheres recapitulate a nichelike microenvir-onment rich in stemness and cell-matrix interactions，rationalizing their enhanced functional potency for myocardial repair［J］.Stem Cells，2010，28(11):2088-2098.

［2］Brenner C，Franz WM.The use of stem cells for the repair of cardiac tissue in ischemic heart disease［J］.Expert Rev Med Devices，2011，8(2):209-225.

［3］倪新海，部朝暉，張宇清，等.大鼠心肌梗死—心力衰竭模型動物存活率的實驗研究［J］.中國實驗動物學雜志，1999，9(4):1-6.

［4］Beltrami AP，Cesselli D，Bergamin N，et al.Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs(heart，liver，and bone marrow)［J］.Blood，2007，110(9):3438-3446.

［5］Siu MK，Wong ES，Chan HY，et al.Overexpression of Nanog in gestational trophoblastic diseases:effect on apoptosis，cell invasion，and clinical outcome［J］.Am J Pathol，2008，173(4):1165-1172.

［6］Siu MK，Wong ES，Chan HY，et al.Circulating very small embryonic-like stem cells in cardiovascular disease［J］.J Cardiovasc Transl Res，2011，4(2):138-144.

［7］Abdel-Latif A，Zuba-Surma EK，Ziada KM，et al.Evidence of mobilization of pluripotent stem cells into peripheral blood of patients with myocardial ischemia［J］.Exp Hematol，2010，8(12):1131-1142.

［8］Wojakowski W，Kucia M，Zuba-Surma E，et al.Very small embryonic-like stem cells in cardiovascular repair［J］.Pharmacol Ther，2011，129(1):21-28.