快速右房起搏制備豬房顫模型及其心肌組織中抗凝血酶測(cè)定的研究

李 飛，張卓琦，張超群，徐 晤，王志榮*

(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生部，江蘇徐州221004;2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

房顫(AF)是臨床上最常見(jiàn)的一種心律失常，總發(fā)病率約0.89%，其中＞60歲年齡組發(fā)病率約為5.9%［1］。栓塞是AF最重要的并發(fā)癥［2］，原因?yàn)樾姆績(jī)?nèi)附壁血栓形成，但機(jī)制尚不明確。2008年10月，我們采用快速右房起搏法制備豬AF模型并采用質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS/MS)［3］對(duì)豬心肌組織中抗凝血酶表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，旨在為進(jìn)一步治療AF提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康家豬12只，年齡2～3個(gè)月，雌雄不拘，體質(zhì)量(37.4±2.5)kg，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組各6只;Protein IEF cell型等電聚焦儀、ProteinⅡⅪcell型垂直電泳槽、GS-800光密度掃描儀;埋藏式高頻率起搏器(南京醫(yī)科大學(xué));“J”形錨狀心房單極電極;固相pH梯度干膠條(IPG dry strip，pH值4～7、17cm)，乙二胺四乙酸(EDTA)，四甲基乙二胺(TEMED)，丙基硫酸鹽(CHAPS)。

1.2 AF模型制備及鑒定 ①模型制備:參考Chen等［4］快速右房起搏法并加以改良。兩組均以3%戊巴比妥鈉麻醉，采用Seldinger血管穿刺技術(shù)穿刺右側(cè)頸內(nèi)靜脈，模型組植入心房單極起搏電極，用起搏分析儀測(cè)量起搏參數(shù)(電壓閾值＜1 V，阻抗500～1 000 Ω)，滿(mǎn)意后將電極尾端與高頻心臟起搏器相連，體外磁鐵設(shè)定參數(shù):起搏方式為AOO，脈沖頻率520次/min，脈沖幅度≥5 V，脈沖寬度0.15 ms，測(cè)試滿(mǎn)意后埋置起搏器。對(duì)照組僅植入電極，不予起搏。兩組術(shù)后均常規(guī)抗感染4 d。②鑒定:AF模型制備前及制備2周后，分別采用程序刺激對(duì)兩組行電生理檢查，其中程序刺激驅(qū)動(dòng)周長(zhǎng)(S1S1)為300 ms，S1S2間期為心房有效不應(yīng)期+50 ms，步長(zhǎng)5 ms反掃直至不應(yīng)期;不能誘發(fā)AF時(shí)引入S3，S2S3間期從S1S2的80%開(kāi)始，步長(zhǎng)5 ms反掃直至S3落入不應(yīng)期;仍不能誘發(fā)AF時(shí)引入S4;S4未能誘發(fā)AF時(shí)，采用12 Hz、脈寬2 ms、4倍閾值的Burst(500次/min)刺激誘導(dǎo)。模型組經(jīng)以上誘發(fā)刺激出現(xiàn)AF者為制模成功［5］，并進(jìn)入下列實(shí)驗(yàn)。

1.3 豬心肌組織中抗凝血酶測(cè)定①心肌組織分離及處理:兩組均于心臟電生理檢查結(jié)束后迅速開(kāi)胸，取出心臟置于冰塊上，生理鹽水洗靜血液，分別剪取心房、心室及室間隔組織，分裝到EP管后置于液氮瓶中凍存24 h，轉(zhuǎn)至-20℃冰箱保存。②雙向電泳及銀染色:參照Lai等［6］方法及Bio-Rad操作手冊(cè)。自冰箱取水化上樣緩沖液I，置室溫溶解后在試管中加入0.01 g DTT，Bio-Lyte 4～6、5～7各2.5 μl，充分混勻。取出400 μl水化上樣緩沖液，加入300 μg樣品，混勻后線性加入水化盤(pán)，置入IPG膠條，覆蓋2～3ml礦物油。將聚焦IPG膠條二次平衡后從樣品水化盤(pán)中移出，浸在1×電泳緩沖液中，放置5min后進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)停止電泳(每個(gè)樣品重復(fù)3次)，通過(guò)固定、敏化、硝酸銀染色、顯影、停顯及脫色，至背景清晰。③圖像分析及質(zhì)譜鑒定:采用GS-800對(duì)上述銀染凝膠進(jìn)行掃描，用PD-Quest TM軟件對(duì)圖像進(jìn)行背景消減、蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配和校正，獲取蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置坐標(biāo)和表達(dá)量分析。選取斑點(diǎn)體積差異比值大于≥60且最優(yōu)離子積分≥30的差異蛋白點(diǎn)，切取后低溫保存送復(fù)旦大學(xué)分鑒定，采用GPS Explore Workstation-MASCOT檢索NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.matrixscience.com)尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示，組內(nèi)、組間比較均使用t檢驗(yàn);P≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AF模型制備情況 兩組術(shù)前行電生理檢查時(shí)均未誘發(fā)出AF。模型組快速起搏2周后關(guān)閉起搏器時(shí)1只豬出現(xiàn)AF，余5只豬經(jīng)程序刺激或Burst刺激均可誘發(fā)出AF，AF持續(xù)時(shí)間(26.41±9.89)min;對(duì)照組AF誘發(fā)情況較術(shù)前無(wú)變化。

2.2 豬心肌組織中抗凝血酶表達(dá) 銀染后PDQuest TM軟件計(jì)算結(jié)果顯示兩組有意義靶點(diǎn)編號(hào)為3708，模型組和對(duì)照組平均灰階度分別為47.4、445.9(P＜0.05);靶點(diǎn)蛋白質(zhì)譜鑒定為抗凝血酶(其蛋白質(zhì)積分為254、最優(yōu)離子積分為59、標(biāo)志性肽段為3)。

3 討論

由于AF發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，治療效果一直不盡理想，故建立理想的AF模型、深入研究AF發(fā)病機(jī)制具有重要臨床意義。20世紀(jì)90年代初，Allessie等［7］采用心外膜方法建立了慢性持續(xù)性AF動(dòng)物模型，鄭方勝等［8］采用快速心房起搏法建立了兔AF模型，但其AF持續(xù)時(shí)間短、誘發(fā)率低、可重復(fù)性差。鑒于豬性格溫和，心臟形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、血管配置均與人心臟相似，故本研究選擇豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。AF有較高致殘率，Kannel等研究表明陣發(fā)性AF患者年中風(fēng)率為11.3%。AF容易形成心房?jī)?nèi)附壁血栓，后者脫落可導(dǎo)致體循環(huán)栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥，但其血栓形成機(jī)制尚不十分明確;Motoki等［9］認(rèn)為AF患者左心房中凝血活性增高，即使在不發(fā)作時(shí)期仍存在凝血高風(fēng)險(xiǎn)。抗凝血酶屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，相對(duì)分子質(zhì)量為58 kU，由432個(gè)氨基酸組成，主要作用為抑制凝血酶和因子X(jué)a，對(duì)Ⅺa、Ⅻa因子及纖溶酶、激肽釋放酶亦有抑制作用。研究顯示，抗凝血酶活性降低與心腦血管內(nèi)血栓形成有一定相關(guān)性［10］，可能機(jī)制為引起凝血酶滅活減少、凝血功能亢進(jìn)。

本研究顯示，植入心臟起搏器、快速心房起搏2周后，采用程序刺激或Burst刺激后均誘發(fā)出AF，證明此制模方法穩(wěn)定可靠。通常認(rèn)為抗凝血酶由肝臟和內(nèi)皮細(xì)胞合成。本研究顯示，模型組右房心肌組織中抗凝血酶表達(dá)顯著低于對(duì)照組。可能機(jī)制:模型組右房組織中內(nèi)皮細(xì)胞功能受損導(dǎo)致抗凝血酶合成減少;其他未探明因素使抗凝血酶消耗增多。本研究未能分離心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞，有關(guān)抗凝血酶的具體表達(dá)位置將在今后使用其他生物學(xué)方法進(jìn)一步探討。

綜上所述，快速右房起搏法制備豬AF模型穩(wěn)定可靠;AF易并發(fā)血栓形成的可能機(jī)制為其心肌組織中抗凝血酶表達(dá)降低。

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