棉花蛋白提取方法及其蛋白質組學研究進展

林必博

（楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100）

蛋白質組是指由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部相應的蛋白質。蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象的學科，其主要研究技術雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）可在同一張凝膠上分離上千種蛋白質，具有大規模、高通量的特點[1]。蛋白質組學研究不僅可以分析有機體內基因組所表達的整套蛋白質，而且可提供大量有機體在各種生理狀態下蛋白質動態變化的信息，深入揭示有機體代謝調控的本質。棉花（Gossypum hirsutum L.）是最有經濟價值的纖維作物，也是重要的油料植物[2]，其研究一直以來受到廣泛關注。

本文主要介紹了棉花蛋白質組學研究中，用于蛋白質樣品提取的2-DE方法以及棉花蛋白質組學的研究進展。

1 棉花蛋白質樣品提取方法

在蛋白質組學研究中，蛋白質樣品的質量好壞決定于2-DE是否能獲得高分辨率的凝膠圖譜和后續分析的準確性。通常來講，所取材料的成分越復雜，蛋白質樣品的制備越困難。棉花組織特別是研究的重點對象棉纖維和胚珠，是一種典型的頑拗性植物組織，含有多糖、酚類復合物、脂類、萜類以及大量的次級代謝物。因此，如何從棉花組織中提取高質量的蛋白質樣品用于蛋白質組學研究顯得尤為關鍵。Graves等[3]采用水法對棉花胚和纖維中的總蛋白進行了提取。林金科等[4]則采用尿素法進行了棉花蛋白質的提取，但2-DE凝膠圖譜效果并不理想。徐子劍等[5]的研究也證明了2-DE凝膠圖譜效果并不理想。目前，棉花蛋白質組學研究中蛋白質樣品的提取，主要參考常用于植物組織總蛋白質提取的三氯乙酸/丙酮沉淀法[6]和酚抽提法[7]。

1.1 三氯乙酸/丙酮沉淀法

三氯乙酸/丙酮沉淀法的要點：在二硫鍵還原劑二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇存在的情況下，采用含10%三氯乙酸（TCA）的丙酮溶液反復對液氮研磨后的組織樣品進行沉淀。操作步驟[8]：（1）在液氮中將胚珠研磨成粉末，懸浮于至少5倍體積的含10%TCA和0.07%β-巰基乙醇的丙酮中（－20℃預冷），充分振蕩混勻，－20℃靜置 2 h 以上；（2）40000g，4 ℃離心 15 min，棄上清，將沉淀懸浮于－20℃的0.07%β-巰基乙醇的丙酮中，充分振蕩；（3）40000g，4 ℃離心15 min，棄上清；（4）將步驟（2），（3）重復 3 次；（5）將沉淀真空冷凍干燥，得到粗蛋白干粉。

1.2 酚抽提法

酚抽提法的要點：在二硫鍵還原劑二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇存在的情況下，采用Tris-HCl（pH值為8.65）提取緩沖液對液氮研磨的組織樣品粉末進行蛋白質抽提，然后加入This-HCl（pH值為8.0）飽和酚，在室溫下振蕩使蛋白質分布于酚相，而后用乙酸銨甲醇溶液從酚相中進行蛋白質沉淀。主要操作步驟[9]：（1）植物組織用液氮研磨至粉末，加入3倍體積的提取緩沖液（500mmol/L Tris-HCl（pH 值為 8.65），50mmol/L EDTA，100mmol/L KCl，2 mmol/L DTT）和3倍體積This-HCl（pH值為8.0）飽和酚勻漿 1 min；（2）12000 g，20℃離心 10min，收集酚相以及界面，丟棄水相與沉淀；（3）酚相加入10倍體積含0.1 mmol/LNH4Ac的預冷甲醇溶液，-20℃過夜；（4）離心，沉淀懸浮于含0.1 mmol/L NH4Ac的冷甲醇，洗滌3次，冷丙酮洗滌1次；（5）將沉淀真空冷凍干燥，得到粗蛋白干粉。

1.3 三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚抽提法提取效果的對比

從2種方法的操作程序比較來看，酚抽提法較三氯乙酸/丙酮沉淀法使用了相對較多的藥品和試劑，需要更長的時間，且酚具有較大的毒性和腐蝕性。劉康等[9]分別用這2種方法提取棉花胚珠和纖維總蛋白質，用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取得到的蛋白質獲得率為2.3 mg/g，雙向電泳后，用膠體考馬斯亮藍染色法染色后檢測的蛋白質點數極少；銀染色后蛋白質點數沒有明顯的增加。而用酚抽提法得到的蛋白質獲得率達到10.4 mg/g，是三氯乙酸/丙酮沉淀法的近5倍，雙向電泳后，用膠體考馬斯亮藍染色法染色后檢測的蛋白質點數可以達到923個；銀染色可以檢測到1061 個蛋白質點。蛋白質點在凝膠圖譜上pH值3～10的范圍均有分布，但主要集中在pH值4.3～8.6范圍。這表明酚抽提法獲得的蛋白質種類較多，pI分布范圍較寬，蛋白質容易溶解。賴童飛等[8]以棉花初生壁形成期的胚珠為材料，通過蛋白質產率、純度測定以及凝膠電泳圖譜上蛋白質點的數量對三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚抽提法進行了比較分析，結果顯示，酚抽提法獲得的蛋白產率高、質量好、種類多。可見，酚抽提法比三氯乙酸/丙酮沉淀法能取得更好的效果。

進一步分析發現，三氯乙酸/丙酮沉淀法可有效抑制蛋白水解酶和修飾酶活性，但對高分子量蛋白質溶解性較差，難于沉淀低分子量蛋白質，造成了損失，同時一些可溶性多糖和酚類多聚體雜質也被提取，因此，提取的蛋白質樣品產率低，且含有較多的雜質；而酚抽提法中，This-HCl（pH值為8.0）飽和酚對蛋白質有很強的溶解能力，使核酸和可溶性多糖分散于水相中[10]，且可以有效減少蛋白質分子與其他分子間的相互作用[11]，所提取的蛋白質樣品不僅產率高，而且具有較好的純度。

盡管現有資料均表明，酚抽提法比三氯乙酸/丙酮沉淀法在蛋白質提取方面具有優勢，且這2種方法所提取的蛋白質在種類上存在一定差異。研究發現，酚抽提法能更有效地對酸性區域以及高分子量和低分子量蛋白進行提取[8]，分析其原因是酚抽提法遠離了酸性環境，提高了對占總數蛋白半數以上的酸性蛋白的溶解度；而三氯乙酸/丙酮沉淀法對高分子量蛋白質溶解性較差和難以沉淀低分子量蛋白質的性質，決定了這2類蛋白質的丟失，這是2種方法所提取蛋白質在種類上存在差異的主要原因。以向日葵等其他植物為材料，對這2種方法提取效果的比較研究也得到了類似的結果[12-14]。

Yao等[15]通過對酚抽提法進行改良，發現在提取過程中，添加交聯聚維酮（PVPP）和十二烷基硫酸鈉（SDS），可獲得更高的蛋白質產率，且蛋白質溶解性和凝膠上蛋白質點的亮度有所提高。

綜上所述，酚抽提法較適合于棉花組織蛋白質樣品的提取。但考慮到酚抽提法和三氯乙酸/丙酮沉淀法所提取蛋白質在種類上的差異，在實際使用中這二者應根據需要相互配合，以便取得更加全面的蛋白質表達信息。此外，值得注意的是，由于棉花組織之間的差異，這2種方法可能有不同的效果，但目前尚未見相關報道。

2 棉花蛋白質組學研究進展

目前，棉花蛋白質組學的研究依然處于探索階段，現有的報道主要集中在棉纖維的發育過程和抗逆性方面。

2.1 棉花發育蛋白質組學分析

采用蛋白質組學研究，可深入分析與發育相關蛋白質表達的變化，有助于進一步揭示棉纖維發育的調控機理。早在1988年，Graves等[3]就探索利用2-DE來研究棉花胚珠和纖維蛋白質，根據-6～20DPA蛋白質表達譜的動態變化，確定了-3 DPA是纖維起始發育的開始。隨后，Turley等[16]在離體培養條件下產生纖維的胚珠中，通過2-DE發現了5個特異表達的蛋白質。但這些研究中，2-DE分離效果并不理想。Ferguson等[7]比較了14 DPA和21 DPA這2個發育階段棉花纖維的蛋白質2-DE圖譜，發現了45個差異表達的蛋白質點，對2個表達差異比較大的蛋白質點進行N-末端氨基酸測序，其中1個被鑒定為細胞質蘋果酸脫氫酶，但由于未進行差異表達蛋白質的全面質譜鑒定，因此，缺少進一步的信息。

王娟等[17]以陸地棉徐州142為材料，比較了棉花纖維伸長及初生壁形成期（10DPA）和次生壁增厚期（25 DPA）蛋白質組的變化，采用MALDI-TOF-MS鑒定了15個差異表達的蛋白質點，并對5種差異蛋白質進行了半定量RT-PCR分析。結果表明，這些差異表達蛋白質分別屬于F-box家族蛋白、肌動蛋白、β-微管蛋白、F1-ATP合成酶、ATP酶β亞基、膜聯蛋白、磷酸甘油酸酯激酶I、胞質蘋果酸脫氫酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、谷氨酰胺合成酶、Cu-Zn超氧化物歧化酶、profilin、4-香豆酸輔酶A連接酶等，反映了棉纖維發育初生壁形成期至次生壁增厚期，與能量代謝、碳代謝、細胞周期調控和發育等相關蛋白質的差異表達，其不足之處是僅分析了2個階段。Yang等[18]則進行了更為全面的研究，對5～25 DPA棉花胚珠和纖維發育5個典型階段的蛋白質表達譜進行了詳細比較，鑒定了106個差異表達蛋白質。分析表明，這些蛋白質參與能量和碳水化合物代謝、蛋白質轉運、細胞應答、氧化還原動態平衡等涉及到棉纖維發育的細胞和代謝調控過程，進而揭示了這些蛋白質的變化與纖維發育的可能關系，為棉纖維發育過程中相關蛋白質的功能研究提供了框架。

2.2 棉花抗逆境差異蛋白質組學分析

目前，已經從多方面進行了抗逆性研究，但應用蛋白質組學的研究鮮有報道。李銳等[19]通過2-DE和質譜技術，對低溫前后不同抗冷級別的棉花品種錦3047和410的蛋白質組進行了比較分析，在抗冷性較強的錦3047中發現50個蛋白質點在低溫脅迫前后的表達量有明顯差異，其中有19個豐度值變大，絕對豐度明顯高于抗冷性較弱的410；11個豐度值變小，絕對豐度低于410；錦3047特有8個蛋白質點表達量上升，而在410中幾乎不表達。通過質譜分析了其中30個蛋白質點，發現逆境蛋白占20%，這些蛋白可能與錦3047的抗冷性具有密切關系。

王雪等[20]以陸地棉低酚棉品種豫無620為材料，在接種黃萎病菌后24，48，72 h提取葉片蛋白質，采用2-DE技術研究棉花在黃萎病菌脅迫條件下葉片蛋白質組的變化。結果表明，棉苗在黃萎病菌脅迫下，3個時間的葉片蛋白質圖譜與未接種對照組均存在顯著差異，病菌脅迫下的棉苗葉片被誘導產生大量新的蛋白質，而且在3個時間均出現了3個差異表達蛋白質點，其通過MALDI-TOF-MS分析和數據庫檢索，分別鑒定為DEAD/H boxRNAhelicase、絲氨酸蛋白酶抑制劑和ODR-3蛋白，推測這些蛋白可能在棉花對黃萎病的抗性反應中發揮作用。

3 展望

與國際棉花生產相比，我國皮棉總產量居世界第一，但棉纖維品質較差[21]。通過蛋白質組學研究，結合基因組學、功能基因組學、生物信息學等，將有助于全面揭示棉纖維的發育機理和品質形成的遺傳基礎，為我國棉纖維品質的改良提供理論依據。抗逆性是棉花研究的重要方面，進一步擴展和深入研究蛋白質組學對棉花的抗逆性，有助于揭示棉花的抗逆機理，為其新品種的選育提供重要的參考依據。

亞細胞蛋白質組是蛋白質組學中的新生力量，分析某一亞細胞結構的蛋白質組成，不僅可降低樣品復雜度，使分析簡單化，而且還可富集亞細胞的低豐度蛋白，具有重要的研究意義[22]。但目前棉花的蛋白質組學研究僅包括棉纖維、胚珠、子葉、葉片等，有待于深入到亞細胞水平。有關棉花的蛋白質組學研究不管是廣度還是深度，仍處于探索階段，大規模、系統化的研究還相對匱乏。相信隨著研究工作的開展，蛋白質組學研究在棉花中的應用將會更加深入廣泛，為棉花的品質改良等研究提供大量信息。

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