睪丸組織中ACRBP的表達及啟動子CpG位點的甲基化分析

黃 巍，范 蓉，李希圣，郭文文，羅 彬，宋 慧，肖紹文，謝小薰*

(1廣西中醫學院第一附屬醫院，南寧530023;2廣西醫科大學組織學與胚胎學教研室)

頂體素結合蛋白(ACRBP)是一種能在睪丸生精細胞和多種腫瘤組織中表達，而在其他正常組織中幾乎不表達的腫瘤—睪丸抗原(CTA)［1］。DNA甲基化是表遺傳學的主要修飾形式，在基因表達調控、發育調節和基因組印跡等方面發揮重要作用。目前發現部分CTA如MAGE、NY-ESO-1、TAG的表達與基因啟動子區域CpG島的去甲基化有關［2～4］。以往，我們已從mRNA水平對ACRBP進行了前期研究，發現其限制性表達于正常組織、選擇性高表達于腫瘤組織，并在大鼠睪丸中檢測到ACRBP。2010年1～12月，我們研究了ACRBP在人睪丸組織中的定位，預測ACRBP啟動子CpG位點序列，探討其CpG位點在人正常睪丸組織中的甲基化狀態及意義。

1 材料與方法

1．1 材料 UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒，rTaq酶、pMD18-T載體，EZ DNA甲基化試劑盒。ACRBP多克隆抗體［5］、人正常睪丸冰凍組織及石蠟組織各1例(由廣西醫科大學組胚教研室提供)，3例正常睪丸組織切片來源于FDA805正常組織芯片，SupervisonTMHRP試劑盒，ACRBP Bisulfite PCR引物。

1．2 實驗方法

1．2．1 ACRBP在人睪丸組織中表達檢測 采用免疫組化法。常規石蠟切片處理，切片經高壓修復后，用抗ACRBP多克隆抗體孵育，用SupervisonTMHRP試劑盒顯色，步驟按試劑盒說明書操作。

1．2．2 ACRBP啟動子CpG位點分析 通過NCBI、BDGP(NeuralNetworkPromoterPrediction)和METHPRIMER分析軟件，對ACRBP基因進行啟動子CpG位點分析，并設計用于Bisulfite PCR的特異性引物。

1．2．3 目的基因CpG位點的甲基化狀態檢測 采用Bisulfite PCR法。用UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒提取人正常睪丸組織DNA，紫外分光光度儀確定DNA含量及純度。取2 μg DNA至0．2 ml EP 管中，用 TE 稀釋至20 μl，加 CT 轉換液130 μl，混勻離心后置PCR儀98℃ 8 min、64℃ 2．5 h、4℃終止反應，再按EZ DNA甲基化試劑盒說明書對DNA進行洗脫，獲得經亞硫酸氫鹽修飾的DNA，－20℃保存。取5 μl修飾后的DNA進行Bisulfite PCR擴增。引物序列:5'-TTTTGGTTATTTTAGGGTTTTGAGA-3'，5'-ACAAATATAAACCTCTCACCCTTCA-3'。PCR反應條件為94℃預變性5 min;94℃變性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環;最后72℃延伸10 min。PCR反應完畢后進行瓊脂糖凝膠電泳。切取瓊脂糖凝膠上的目的條帶(237 bp)，進行純化，用T4連接酶將該片段連接到T克隆載體上，轉化DH5α菌株，通過藍白斑篩選與PCR鑒定(模板取0．5 μl，余條件同Bisulfite PCR)，挑選10個陽性菌落測序，分析目的基因CpG位點的甲基化狀態。

1．3 統計學方法 采用SPSS13．0統計軟件。

2 結果

2．1 ACRBP在人睪丸組織中的表達 4例人正常睪丸組織均出現ACRBP的陽性反應。ACRBP分布于生精小管上皮，呈區域性分布。精子與精子細胞及部分的精原細胞和精母細胞表達目的蛋白，支持細胞為陰性。

2．2 ACRBP啟動子CpG位點 通過NCBI查詢，獲知 LPAR5(6728001～6745297)、ACRBP(6747242～6756580，其轉錄單位起始于6756580)和 ING4(6759704～6772308)三個基因在12號染色體上的相鄰位置，且轉錄方向是逆向。進一步經 WWW Promoter Scan分析，結果顯示ACRBP啟動子的區域可能為其轉錄起始點－184～+67 bp，啟動子分數為83．73(Cutoff分數為53．00)。取 ACRBP DNA 全序列前4 000 bp進行METHPRIMER分析，在轉錄起始點－316～+606 bp區域共有4個CpG島，Bisulfite PCR擴增的序列位于ACRBP轉錄起始點－127～+110 bp之間，該區域共存在24個CpG位點。

2．3 目的基因CpG位點的甲基化狀態 Bisulfite PCR和陽性克隆PCR鑒定的產物均可在瓊脂糖凝膠上的200～300 bp出現陽性條帶。對10個陽性克隆的測序結果經 BLAST，證實擴增的序列與ACRBP啟動子序列(轉錄起始點－127～+110 bp)匹配。10個克隆中有3個克隆出現CpG位點甲基化修飾，24個CpG位點中有3個出現甲基化，其甲基化頻率為1．67%。每個CpG位點出現甲基化頻率的95%可信區間為＜3．7%，所分析ACRBP啟動子區域(－127～+110 bp)的CpG位點處于低甲基化狀態。

3 討論

ACRBP參與精子獲能、協助單精入卵及精子頂體蛋白的包裝與濃縮，是一種特異性的精子蛋白［6］。本世紀初通過基因表達系列分析技術，發現該基因具有編碼CTA基因的特點［1］。目前，已發現140多個CTA成員，由70多個CTA基因家族或基因編碼［7］。CTA除了在多種腫瘤組織表達外，正常組織中僅表達于生精細胞。精子發生的不同階段能夠表達不同的 CTA蛋白，如 MAGE、NY-ESO-1和SSX家族主要在精原細胞和初級精母細胞中表達;SCP-1只在處于第一次成熟分裂前期的初級精母細胞內;SPANX主要在單倍體的精子細胞和精子中表達［7］。基因表達的調控主要通過遺傳學和表觀遺傳學兩種機制實現，表觀遺傳學是一種不涉及核苷酸序列變化可遺傳的基因表達方式的改變，DNA甲基化是表觀遺傳學的主要修飾形式。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶的催化下，以5-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶的反應。由于發現多種CTA啟動子CpG位點在腫瘤組織和睪丸組織中均處于低甲基化狀態，一些學者認為可能與腫瘤發生過程中體細胞甲基化狀態的改變有關，去甲基化作用是控制多種CTA基因表達的主要調節機制。

本研究發現，ACRBP在精子與精子細胞及部分的精原細胞和精母細胞表達，生精小管管壁呈區域性的陽性反應，可能與生精小管內各區域精子發生的不同步有關。并首次應用生物信息學分析預測了ACRBP啟動子區域序列，測序結果證實該序列與目的基因匹配。生物信息學分析可以快捷自動化分析提交的DNA序列，預測CpG島和CpG位點。通過Bisulfite PCR測序法發現ACRBP啟動子CpG位點為低甲基化狀態，與其他CTA在睪丸組織中甲基化狀態相似［8］。目前，已知甲基化抑制劑氮雜脫氧胞嘧啶可以上調MAGE、SSX和NY-ESO-1的表達。這些CTA蛋白均主要在精子發生的早期階段(精原細胞和初級精母細胞)表達。近年來有關DNA甲基化與生殖功能的研究不斷深入，在生殖細胞發育過程中，DNA甲基化模式經歷了去甲基化以及隨后重新甲基化的過程［9］。因此，在精子發生后期階段表達的ACRBP，其在精子發生過程中的表達機制與DNA甲基化的相關性尚需做進一步研究。

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