膀胱移行細胞癌中間隙連接蛋白Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA和Bax mRNA的表達及其相關性研究

吳志平，趙曉昆，呂 晨，楊明根，肖 寧

細胞間隙連接 (gap junction，GJ)是普遍存在于動物組織細胞間的一種通訊方式，主要由間隙連接蛋白 (connexin，Cx)所構成。細胞通過細胞間隙連接通訊 (gap junction intercellular communication，GJIC)進行細胞間信號的傳遞，調控細胞的新陳代謝、增殖、分化等生理過程，對機體的代謝平衡及生長發育有重要意義［1］。研究發現GJ與腫瘤的發生、發展及侵襲轉移潛能密切相關，其中Cx43是一種主要的細胞間隙連接蛋白，在多種癌細胞中都有Cx43表達的下降，是研究的熱點［2］。本研究通過半定量RT－PCR的方法檢測Bcl－2 mRNA，BaxmRNA及Cx43mRNA在膀胱移行細胞癌 (BTCC)組織中的表達，探討Cx43基因與凋亡相關基因Bcl－2、Bax蛋白表達的相關性及其生物學意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007年6月—2008年6月中南大學湘雅二醫院泌尿外科手術切除并經病理證實的BTCC患者新鮮組織標本35例，癌組織取腫塊非壞死部分。選擇同期BTCC患者距腫瘤邊緣2 cm的癌旁組織21例、正常膀胱組織15例，其中良性前列腺增生手術取正常膀胱組織9例，BTCC患者手術取距腫瘤邊緣＞5 cm膀胱組織6例。35例BTCC患者術前均未行任何放、化療，其中男21例，女14例;年齡38～72歲，平均 (58.6±10.2)歲;初發腫瘤23例，復發腫瘤12例;腫瘤單發21例，多發14例;腫瘤直徑＜3 cm 18例，≥3 cm 17例;腫瘤分期:Ta～1期24例，T2～4期11例;腫瘤分級G1級15例，G2級11例，G3級9例。

1.2 主要試劑 Bcl－2、Bax、Cx43和人肌動蛋白 (β－actin)引物由上海生工生物工程公司合成，RT－PCR試劑盒(兩步法)購自Promega公司，PCR產物回收純化試劑盒、Taq DNA聚合酶和dNTPs試劑購自Takara公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司。

1.3 實驗方法 所有標本 (腫瘤組織、癌旁組織，正常膀胱組織)經－196℃液氮罐取回并置于－70℃冰箱保存。

1.3.1 引物設計 根據Bcl－2、Bax、Cx43、β－actin的mRNA序列 (genebank序列號NM_000633、NM_138764、NM_000165、NM_001101)，應用在線引物設計軟件primer3設計相關引物 (見表1)。

1.3.2 組織標本總RNA的提取與鑒定 各種標本分別取50～100 mg組織，用勻漿器將組織徹底勻漿后，在冰上加入1 ml Trizol，提取組織總RNA，提取步驟參照Trizol試劑的說明書進行。用Trizol提取組織總RNA的吸光度比值 (即OD260/OD280值)均達1.7～1.9。

1.3.3 半定量RT－PCR檢測 RT－PCR按照TaKaRa兩步法試劑盒的說明操作，以Oligo－dT為引物反轉錄cDNA模板后，進行PCR反應。PCR反應條件為95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s3 min，循環30次，再72℃ 10 min。PCR結束后，分別取5 ml產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統掃描并測定標本的灰度值，重復3次并計算Bcl－2、Bax及Cx43與β－actin的表達比值來判斷 Bcl－2 mRNA、Bax mRNA及Cx43 mRNA的相對表達水平。

表1 mRNA序列引物設計Table 1 mRNA sequence of primer design

1.3.4 PCR產物測序及BLAST比較分析 分別用合成的引物對PCR產物進行測序，運用DNASTAR軟件中的Seqman對測序結果進行分析，證實RT－PCR產物與目的mRNA序列是否同源。

1.4 統計學方法 使用SPSS 13.0統計軟件包處理數據，計量資料用 (x－±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Cx43mRNA、Bcl－2mRNA及BaxmRNA在BTCC、癌旁組織及正常膀胱組織中的表達 RT－PCR擴增3種組織中的Cx43、Bcl－2、Bax基因，擴增產物經凝膠圖像分析儀分析電泳結果見圖1。分析其表達水平 (OD比值):Cx43/β－actin、Bcl－2/β－actin及Bax/β－actin。3種組織中Cx43mRNA表達水平比較，差異有統計學意義 (P＜0.01)，其中BTCC組織中Cx43 mRNA的表達低于癌旁組織及正常膀胱組織，差異有統計學意義 (P＜0.01)。Bcl－2 mRNA在BTCC組織高表達，而在癌旁組織及正常膀胱組織中表達較低，差異均有統計學意義 (P＜0.01)。BaxmRNA在BTCC組織、癌旁組織及正常膀胱組織中的表達水平比較，差異無統計學意義 (P＞0.05);癌旁組織與正常膀胱組織中，Cx43 mRNA和Bcl－2 mRNA的表達水平比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表2)。

表2 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA及Bax mRNA在組織中的表達 (x－±s，OD比值)Table2 The expression of Cx43mRNA，Bcl－2mRNA and BaxmRNA in 3 tissues

圖1 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA和BaxmRNA在組織中的表達Figure 1 The expression of Cx43 mRNA，Bcl－2 mRNA and BaxmRNA in 3 tissues

2.2 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA及Bax mRNA表達水平與BTCC臨床病理特征的關系 Cx43 mRNA的表達水平在BTCC不同的病理分級間比較，差異有統計學意義 (P＜0.01)，而與患者的腫瘤分期和腫瘤有無復發比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。Bcl－2 mRNA的表達水平在BTCC不同的病理分級間比較，差異有統計學意義 (P＜0.01)。復發BTCC組織中Bcl－2 mRNA的表達水平高于初發癌組織，差異有統計學意義 (P＜0.05)。Bcl－2 mRNA的表達水平與患者的腫瘤分期比較，差異無統計學意義 (P＞0.05)。BaxmRNA的表達水平與BTCC患者的腫瘤分期、病理分級、腫瘤有無復發比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表3)。

2.3 PCR產物測序及BLAST分析 分別用合成的引物對PCR產物進行測序，運用DNASTAR軟件中的Seqman II對測序結果進行分析，證實Cx43、Bcl－2和Bax RT－PCR產物與目的基因Cx43、Bcl－2、BaxmRNA序列完全一致 (見圖2)。

表3 Cx43 mRNA、Bcl－2mRNA及BaxmRNA的表達與BTCC臨床病理特征的關系 (x－±s，OD比值)Table 3 Relation of Cx43 mRNA，Bcl－2 mRNA and BaxmRNA expression with the clinicopathologic features of BTCC

圖2 Cx43、Bcl－2、Bax和β－actin基因RT－PCR產物測序結果Figure 2 The sequencing results of Cx43，Bcl－2，Bax andβ－actin gene by RT－PCR

3 討論

GJ是普遍存在于動物組織細胞間的一種通訊方式，相鄰細胞間通過GJIC進行細胞間信號的傳遞及信息和能量物質的交換，調控細胞的新陳代謝、增殖、分化等生理過程，對細胞的生長、分化和凋亡等生理過程起著重要的調控作用，而對機體的代謝平衡及生長發育有重要意義［1］。近年來的研究發現，在腫瘤和轉化細胞中普遍存在著Cx表達異常和GJIC功能缺陷［3］，提示GJIC與腫瘤發生、發展存在密切關系。GJ主要由Cx構成，Cx是一個多成員、發育上保守的大家族，目前命名的人類Cx家族成員已達21個［4］。其中 Cx43是一種主要的Cx，是間隙連接蛋白家族中分布最廣、研究最多的成員，其基因表達的產物是一種磷酸化蛋白。Wilgenbus等［5］通過人腫瘤組織的冷凍切片，以免疫組織化學方法研究乳腺癌、腎細胞癌和肉瘤組織中 Cx26、Cx32和 Cx43的表達，發現 Cx26、Cx32和Cx43水平明顯下降。范松青等［6］通過對不同癌組織和癌旁組織Cx43表達的研究，認為Cx43表達的缺乏或下調可能導致腫瘤的發生和發展。本研究結果顯示，Cx43 mRNA在正常膀胱組織有很高的表達率，說明Cx43基因產物在正常膀胱組織內調控細胞的生長、分化和凋亡等生理過程，對正常膀胱組織功能的維持起著重要作用。Cx43 mRNA在BTCC組織中的陽性表達明顯低于正常膀胱組織及癌旁組織，Cx43在BTCC中的弱表達，表明Cx43表達下降，功能性GJ通道形成減少，故GJIC功能減弱或被抑制，使來自正常細胞的生長調控信號不能到達腫瘤組織，機體失去對腫瘤細胞生長的控制，而導致腫瘤細胞無限制的自主性生長，提示間隙連接蛋白可能與多種致瘤因素共同參與了移行細胞癌的發生。國外學者通過反義核酸技術等阻斷細胞Cx的表達和GJIC功能，結果導致這些細胞失去生長的控制，易形成腫瘤。這說明Cx表達的異常很可能是腫瘤 (包括BTCC)多步驟癌變過程中的重要分子機制之一［7－8］。本研究結果顯示，Cx43 mRNA的表達和臨床病理特征的關系表明Cx43的表達與BTCC的病理分級有關，與患者的腫瘤分期和腫瘤有無復發等無關。因此Cx43 mRNA的表達水平可作為BTCC分化程度和浸潤轉移能力的診斷指標。

Bcl－2和Bax是Bcl－2家族中調控腫瘤細胞凋亡中重要的一對基因，在多種上皮腫瘤中都有異常表達。現已發現Bcl－2蛋白異常表達與包括膀胱癌在內的人類多種惡性腫瘤的關系密切［9］。本研究結果發現，Bcl－2 mRNA在BTCC組織中的陽性表達明顯高于正常膀胱組織及癌旁組織，并隨BTCC病理分級的增高而增高，而且復發BTCC組織中Bcl－2 mRNA的表達水平高于初發BTCC。而BTCC關于Bax的表達，文獻報道不一致。本研究結果發現BaxmRNA的表達在正常膀胱組織中與在BTCC組織中的表達無差異，在腫瘤各期、不同病理分級BTCC中其表達亦無差異，即表達相對恒定。有學者報道，Bcl－2在移行上皮組織有表達，但遠低于癌組織，而且與惡性程度呈正相關;Bax在正常移行上皮組織與癌組織均有表達，與腫瘤分期及病理分級均無關。這種現象表明Bcl－2或Bcl－2/Bax比值可能在BTCC的惡性進展起重要作用［10－11］。

研究發現有許多促癌物通過抑制Cx的途徑阻斷GJIC后，細胞增殖和凋亡的調控信號傳遞失控，最終導致腫瘤生長，而凋亡的誘導劑可以增強Cx表達和GJIC功能，從而抑制腫瘤的生長和惡性轉化，說明GJIC功能異常與癌癥的發生有密切關系［12］。Krutovskikh等［13］對鼠膀胱癌細胞株 BC31 細胞的研究發現Cx43表達上調，GJIC功能增強，促進了細胞間信號的傳導，增加細胞間Ca2+流的傳導，最終誘導腫瘤細胞凋亡。本研究結果顯示，BTCC組織中Bcl－2 mRNA高表達，Cx43 mRNA為低表達，提示Cx43 mRNA的表達與Bcl－2蛋白的表達水平相反，Cx43基因可能與凋亡相關基因Bcl－2(或Bcl－2/Bax)在BTCC的發展中起拮抗作用，其表達水平與細胞的凋亡過程有關。

綜上所述，通過對BTCC組織Cx43 mRNA的表達及其與Bcl－2 mRNA/Bax mRNA表達的相關性的研究，發現Cx43表達下調與BTCC的發生、進展及其惡性特征有關，并且其表達水平與細胞的凋亡過程有關。如果能夠通過藥物或基因誘導促進Cx43的表達，恢復細胞的GJIC功能，抑制腫瘤細胞，將為膀胱移行細胞癌的診治研究提供新的思路。

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