消腫噴劑促進急性軟組織損傷大鼠損傷修復的實驗研究

牛淑亮 劉鳳霞 王海龍 廖 靜 新疆醫科大學基礎醫學院(烏魯木齊 830011)

消腫噴劑為蘇梔消腫膏改良制劑,主要由蘇木、梔子、姜黃、延胡索、制乳香、制沒藥、三七、血竭、冰片等多味中藥組成,具有活血祛瘀、舒筋活絡、消腫止痛作用。臨床應用治療跌打損傷,各種骨折后軟組織腫脹、疼痛 1583例 ,效果良好。為探討其促進急性軟組織損傷修復的作用機理,筆者進行了實驗觀察:

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康 SD大白鼠 48只,雌雄各半,體重200～ 220g(新疆醫科大學大學實驗動物中心提供)。

1.2 實驗用藥 消腫噴劑 (蘇木、梔子、姜黃、延胡索、制乳香、制沒藥、三七、血竭混勻,浸泡于 60%酒精中,每天攪拌 1次,10d后過濾 ,取濾液,再加冰片 ,溶解后分裝)。對照藥物選用正紅花油。

1.3 實驗儀器 軟組織打擊器(自制),Labsystems Multiskan M S352型酶標儀,Thermo Labsystems AC8洗板機,TG16W微量高速離心機,GNP-9080型隔水式恒溫培養箱,ELISA Kit for Rat IL-1β(美國 RD公司進口分裝 ,生產批號:20100615)

2 實驗方法

造模方法參照文獻[1]略加改造:SD大白鼠 36只 ,實驗前1d禁水禁食,以 8%硫化鈉溶液右后肢脫毛。實驗前,以 3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,注射劑量:1.5mL/kg,麻醉成功后將大鼠固定在自制打擊器上,將 200g重的砝碼通過與砝碼直徑相當的塑料管中自 20cm高處垂直自由落體沖擊大鼠大腿外側肌肉豐厚處,連續打擊 2次 ,打擊面積約 1cm×2cm,造成打擊局部出現散在出血點,皮下瘀腫創面及腫脹的非開放性軟組織損傷模型[2]。排除皮膚破損或骨折者,并已經解剖及組織學驗證成功率為 100%。

造模成功的大鼠按隨機數字表法分為將大鼠隨機等分為 3組:模型組,正紅花油藥物對照組和消腫噴劑藥物治療組。12只未打擊大鼠為空白組。模型組、空白組不予給藥,對照組與治療組每天早晚各外拭給藥一次,連續給藥 5d。各組均給予正常飼食。造模后 1,3,5 d二次給藥前,分 3批處死大鼠,以打擊部位為中心,沿損傷處切取肌肉組織,備用。

3 觀察評分標準 每天二次給藥前觀察記錄 1次,并根據相應標準,給予評分。

3.1 病情程度評估 大鼠損傷局部損傷情況及活動度,并給予評分。評分標準[3]:觸痛:觸之疼痛反應明顯 3分,觸之疼痛反應輕 2分,觸之無疼痛反應 1分;腫脹:紅腫面積 0.5cm2及以上 3分,紅腫面積 0～ 0.5 cm22分 ,無紅腫 1分。 功能障礙:明顯跛行 3分,跛行不明顯 2分,無跛行 1分。

3.2 損傷征候評分 觀察傷肢瘀斑、腫脹和肌肉顏色等征候表現,并給予評分。評分標準[4]:皮下瘀血:多量塊狀計 2分,少量點狀計 1分,無瘀血者計 0分;肌肉腫脹:明顯腫脹計 2分,稍有腫脹計 1分,無腫脹者計 0分;肌肉顏色:紫暗色深計 2分,暗紅色淺計 1分,色澤正常計 0分。

3.3 組織形態學觀察評分 將取材組織進行石蠟切片,HE染色并在光學顯微鏡下觀察組織學形態,并分級評分[1]:充血出血:血管大片充血計 3分,血管中度充血或灶性出血計 2分,個別血管輕度充血計 1分,血管無充血計 0分。炎癥:大量炎細胞彌漫浸潤計 3分,較多炎細胞片狀浸潤計 2分,少數炎細胞散在浸潤計 1分,無炎細胞浸潤計 0分。變性壞死:組織大片壞死計 3分,組織廣泛變性計 2分,局部組織變性計 1分,無變形壞死計 0分。

[(21.6-8.8)×0.65+(0.731-0.26)×317.5] ×270×12=51.15(萬元)

3.4 白細胞介素-1β(IL-1β)檢測 將取材組織用生理鹽水漂洗 1min,濾紙吸干,分析天平稱取組織 100mg,按照 5mL/100 mg加入生理鹽水,勻漿器中均勻緩慢研磨 15 min,至勻漿液呈均勻懸濁液,倒入試管中,2 500 r/min高速冷凍離心機離心 15min,收集上清液,置于-20℃冰箱中備用。用 ELISA法測定 IL-1 β的含量,具體操作步驟嚴格按照試劑盒操作說明完成。

4 統計學方法

5 實驗結果

5.1 病情程度評估 第 1d各造模組大鼠的病情評分比較,差異無統計學意義;治療過程中各造模組的病情評分逐漸下降,治療 3d后和 5d后,同期紅花油組、消腫噴劑組的病情評分明顯低于對照組組。差異有統計學意義,同一觀察時段,紅花油組、消腫噴劑組之間差異無統計學意義。各組病情程度評估結果見表 1。

表1 各組大鼠治療后不同時期病情評分結果(±s)

表1 各組大鼠治療后不同時期病情評分結果(±s)

組別 第1天 第 3天 第 5天空白組 3.00± 0.00 3.00± 0.00 3.00± 0.00模型組 8.00± 0.90 6.17± 0.76 4.66± 0.59紅花油組 8.00± 0.63 4.67± 1.03 3.30± 0.56消腫噴劑組 7.83± 0.75 4.50± 1.02 .00± 0.00

5.2 損傷證候評分 損傷征候指數觀察造模后大鼠傷肢迅速出現腫脹、皮膚瘀斑及皮下出血現象,傷勢以傷后第 1天最明顯,隨后漸輕,至第 5天腫脹基本消退,局部或肢體遠端殘留皮膚瘀斑。

消腫噴劑組和紅花油組與模型組比較,傷肢腫脹程度低,消退速度快,在傷后第 3天已見明顯消退,瘀斑的消散情況亦優于模型組。損傷證候指數評分損傷后 1d,紅花油組與模型組組間無明顯差異性(P＞0.05),消腫噴劑組與模型組組間具有明顯差異性(P＜0.05),損傷后 3d,5d,消腫噴劑組和紅花油組與模型組組間均具有明顯差異性(P＜0.01)。各組大鼠治療后不同時期的損傷證候評分結果見表 2。

表2 各組大鼠治療后不同時期損傷證候評分(±s)

表2 各組大鼠治療后不同時期損傷證候評分(±s)

組別 第1d 第3d 第5d空白組 0 0 0模型組 5.67± 0.51 4.83± 0.75 3.00± 0.88紅花油組 5.00± 0.62 3.00± 0.88 1.83± 0.75消腫噴劑組 4.17± 0.75 3.00± 0.88 1.00± 0.89

5.3 組織形態學觀察評分

治療后第 3天模型組見肌肉廣泛的充血水腫,玻璃樣團快狀,橫紋消失,肌核增生,較多中性白細胞浸潤。紅花油組與消腫噴劑組充血、水腫減輕,少數肌纖維淡染,肌間質及血管周圍可見少量中性細胞浸潤。

治療后第 5 d模型組部分肌纖維紅染,少量肌纖維扭曲,排列紊亂,偶見紅細胞瘀積現象,白細胞呈彌漫性浸潤。紅花油組與消腫噴劑組見少量充血水腫,白細胞浸潤以及肌漿碎裂不明顯,肌纖維形態大致正常。

組織形態學觀察評分損傷后各觀察時段,模型組與消腫噴劑組和紅花油組組間均具有顯著差異性(P＜0.05或 P＜0.01)。各組大鼠治療后不同時期組織形態學觀察評分結果見表3。

表3 各組大鼠治療后不同時期組織形態學觀察評分(±s)

表3 各組大鼠治療后不同時期組織形態學觀察評分(±s)

組別 第3天 第 5天空白組 0 0 0模型組 8.66± 0.53 7.17± 0.74 5.56± 1.03紅花油組 6.67± 0.53 4.83± 0.76 3.67± 0.81消腫噴劑組 6.67± 0.72 5.67± 0.81 3.33± 0.81

5.4 局部 IL-1β含量

經 3d治療,空白組與各造模組比較具有顯著差異性(P＜0.05);模型組與紅花油組、消腫噴劑組比較具有顯著差異性(P＜0.05);紅花油組、消腫噴劑組之間無統計學意義(P＞0.05)。

經 5d治療,空白組與模型組比較具有顯著差異性(P＜0.05),與紅花油組、消腫噴劑組比較差異無統計學意義(P＞0.05);紅花油組、消腫噴劑組之間無統計學意義(P＞0.05)。治療3 d、5 d后局部 IL-1 β 含量見表 4。

表4 治療 3d、5d后局部 IL-1β含量 (±s)

表4 治療 3d、5d后局部 IL-1β含量 (±s)

組別 第3d 第5d空白組 7.03± 1.83 8.16± 1.80模型組 17.99± 3.02 13.60± 1.18紅花油組 13.08±1.84 8.49±1.77消腫噴劑組 13.24±1.26 8.52±1.91

6 結 果

軟組織損傷是由各種致傷因素作用于機體而引起軟組織損傷的一系列病理變化的疾病,主要病理表現為損傷局部的炎癥反應和炎性介質的釋放增加、酸性產物的積聚,使得損傷局部發生微循環障礙,毛細血管破裂、通透性增加,血管張力下降,血流減緩甚至瘀積,繼而加重炎癥反應。因此,氣滯血瘀,筋脈阻滯是急性筋傷的病機,治療應以活血化瘀之藥,直接作用于局部,可使瘀血速去、腫脹疼痛盡快消除。

現代藥理學研究表明,抑制無菌性炎性滲出,改善微循環,促進水腫吸收,減輕局部損傷,有利于創傷組織的修復愈合[5,6]。消腫噴劑所含藥物蘇木可以減少細胞培養上清液中 IL-2的生成[7]。梔子提取物京尼平苷具有較好的治療軟組織損傷的作用[8]。 姜黃素對 IL-8、 M IP-1 α、MCP-1、 IL-1b及 TNF-α有抑制作用。乳香乙醇提取物可抑制大鼠體內的多形核白細胞浸潤[9]。諸藥合用有明顯活血化瘀、消腫止痛作用。

研究結果表明消腫噴劑能夠抑制損傷局部 IL-1 β表達 ,且在治療 3 d,5 d后與模型組比較具有顯著差異性,經 5 d治療后,消腫噴劑組與空白組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。消腫噴劑對損傷局部炎癥反應具有抑制作用,從而發揮發揮對急性軟組織損傷動物模型有治療作用。

綜合本研究,消腫噴劑可明顯改善急性軟組織損傷動物模型癥狀、癥候,加速傷肢組織修復,抑制損傷局部炎性細胞因子IL-1 β表達,加速損傷組織修復。但其深入的機理尚有待進一步探討。

[1] 周國林 ,姚全勝,潘玉英.一種動物軟組織損傷的實驗方法 [J].中國藥理學通報 ,1991,7(5):396-398.

[2] 李衛星,譚大琦,李秋華,等.消瘀止痛膏對大鼠急性軟組織損傷的治療作用 [J].中醫正骨,2000,12(11):11.

[3] 蘇培基,梁必如.傷科洗方的實驗研究 [J].中醫正骨,2002,14(12):11-12.

[4] 何朝勇,李 楠,陳麗華,等.奇正消痛貼治療急性軟組織損傷實驗研究[J].中醫正骨,2008,20(11):9.

[5] 陳迎春 ,高紹芳,邸淑珍.舒筋涂劑治療急性軟組織損傷的實驗研究 [J].陜西中醫,2009,30(4):490-491.

[6] 張根印,牛淑亮,楊 寧.蘇梔消腫膏對急性軟組織損傷模型大鼠血液流變學的影響 [J].陜西中醫學院學報,2008,31(3):49-50.

[7] 姚全勝,周國林.梔子抗炎、治療軟組織損傷有效部位的篩選研究[J].中國中藥雜志,1991,16(8):486-488.

[8] SharmamL,KhajuriaA,KaulA,eta.l Effectof salai guggalBoswellia serrataon cellularand humoral immune responses and leuco-cytemigration[J].Ital JBiochem,1988,24(1-2):161.

[9] 潘鑫鑫,嚴晴山.人參、西洋參及三七總皂甙對大鼠血小板功能及血栓形成的抑制作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,1993,7(2):14.