Paxillin在胃腺癌和癌前期變化中的表達及意義

許文集，莊瑛瑛，陳玉麗，莊則豪，王承黨

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，一般認為其發生是一個多因素參與、多階段演進的過程。目前認為，慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是胃腺癌 (gastric adenocarcinoma，GAC)的癌前期狀態，腸上皮化生 (intestinal metaplasia，IM)和異型增生 (dysplasia，Dys)是GAC重要的癌前期病變。然而，其確切的發生機制尚未闡明。Paxillin是一種黏著斑相關蛋白，主要存在于黏著斑，而黏著斑是細胞與細胞外基質 (extracellular matrix，ECM)的接觸點，構成ECM與細胞骨架聯系的紐帶，也是信號轉導的主要部位，促進信號從胞外基質經整合素途徑向細胞內傳遞［1］。多項研究已表明Paxillin有參與動態調節黏著斑、調節細胞移動和播散等功能［2－3］，陽性表達與腫瘤的侵襲、轉移相關［4］，改變Paxillin的磷酸化狀態，足以關鍵性地調控細胞的遷移［5］。

本研究通過應用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶 (S－P)染色方法檢測Paxillin在GAC及癌前期變化(CAG、IM、Dys)組織中的表達情況，并以慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)組織作為對照，探討Paxillin在GAC發生、發展中的作用以及其與GAC病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 病例來源

1.1.1 GAC組 選自福建醫科大學附屬第一醫院2005年6—12月間經手術切除、病理確診、剔除術前接受過化療或放療的GAC組織標本59例，其中男50例，女9例;年齡37～81歲。按世界衛生組織 (WHO)腫瘤病理學與遺傳學分類GAC的組織學分型標準，高分化GAC 9例，中分化GAC 25例，低分化GAC 25例;早期GAC 9例，進展期GAC 50例;無淋巴結轉移30例，伴淋巴結轉移29例。

1.1.2 CSG組及癌前期變化組 連續選取本院同期胃鏡下活檢且經病理確診的組織標本，輕度CSG 30例，其中男14例，女16例;年齡21～68歲。中度CAG 30例，其中男19例，女11例;年齡21～73歲。中重度IM 30例，其中男14例，女16例;年齡24～68歲。中重度Dys20例，其中男17例，女3例;年齡32～77歲。

1.2 試劑 鼠抗人Paxillin單克隆抗體 (產品編號:Clone 5H11):NeoMarkers產品，工作濃度1∶200。免疫組化染色超敏試劑盒 (產品編號:LHK611抗小鼠)(含S－P免疫組化染色試劑與DAB顯色劑)，購自深圳晶美生物工程有限公司。磷酸鹽緩沖液 (PBS緩沖液，0.01 mol/L，pH=7.4)和枸櫞酸鹽緩沖液 (Citrate抗原修復液，0.01 mol/L，pH=6.0)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，用雙蒸水配制。

1.3 實驗方法 所有標本經常規甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm連續切片，貼于預先涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60℃烤箱過夜，保存于4℃冰箱中。采用免疫組織化學S－P染色方法檢測Paxillin，操作按說明書進行。陽性對照分別由購買相應抗體的試劑公司提供，同時用PBS替代第一抗體作陰性對照。采用OLYMPUS BH－2光學顯微鏡 (OLYMPUS Co.)、Motic圖像分析儀 (北京麥克奧迪圖像技術有限公司)觀察并攝片。

1.4 實驗結果判斷與圖像分析 光鏡下雙盲閱片，獨立觀察每張切片5個具有代表性的高倍視野，每個視野計數200個細胞。具體判斷標準如下:Paxillin定位于細胞質和 (或)細胞膜，以細胞質和 (或)細胞膜出現棕黃色染色為陽性信號。(1)根據染色程度進行評分:染色強度弱者 (淡黃色或僅個別細胞呈黃至棕黃色染色)為1分，染色強度強者 (呈黃至棕黃色染色)為3分，染色強度中等者 (染色強度介于弱者和強者之間)為2分;(2)根據著色細胞百分率進行評分:著色細胞占計數細胞百分率＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。將每張切片染色強度得分與著色細胞百分率得分各自相乘，為其最后得分。得0～1分為陰性 (－)，得2～3分為弱陽性 (+)，得4～5分為中等陽性 (++)，≥6分為強陽性 (+++)。

1.5 統計學方法 應用SPSS 12.0統計軟件包進行統計學處理，采用非參數檢驗及等級資料Spearman秩相關分析。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Paxillin在腺癌細胞胞質均呈彌漫性中等至強陽性染色，CSG細胞僅胞膜淡染，與CSG組相比，CAG組、IM組、Dys組及GAC組中Paxillin表達均有不同程度的增強，差異有統計學意義 (p＜0.05);與GAC組相比，CAG組、IM組及Dys組中Paxillin表達均較低，差異有統計學意義 (p＜0.05);而IM組與Dys組間Paxillin表達差異無統計學意義 (P＞0.05);Paxillin表達程度和胃黏膜病變程度呈正相關 (rs=0.779，P=0.000)，隨胃黏膜病變程度的加重，Paxillin表達逐漸增強(見表1，圖1～6)。

表1 Paxillin在GAC、癌前期變化及CSG中的表達［n(%)］Table 1 The expression of Paxillin in GAC，preneoplastic changes and CSG groups

圖1 CSG細胞膜淡染 (×400)Figure 1 Only light staining was found in CSGcells

圖2 CAG細胞膜和細胞質不均勻染色 (×400)Figure2 Asymmetrical staining was found in CAGcells

圖3 IM細胞彌漫染色 (×400)Figure3 Moderately staining was found in IM cells

圖4 Dys細胞彌漫染色 (×400)Figure 4 Moderately staining was found in Dys cells

圖5 高分化GAC細胞彌漫較強染色 (×400)Figur e5 St r ongl yandasyst emat icst ainingwasf oundinwel l－dif f er ent iat edGACcel l s

圖6 低分化GAC細胞彌漫強染色 (×400)Figure6 St rongl yandasystemat icst ainingwasf oundinpoor－dif f er entiat edGACcel l s

2.2 進展期及伴淋巴結轉移GAC組中Paxillin表達程度高于早期及無淋巴結轉移GAC組，差異均有統計學意義 (p＜0.05);高分化、中分化和低分化GAC組間Paxillin表達比較，差異有統計學意義 (p＜0.05)，其中中分化和低分化GAC組間Paxillin表達差異無統計學意義 (P＞0.05)，中、低分化組Paxillin表達高于高分化組，差異有統計學意義 (p＜0.05，見表2)。

表2 Paxillin表達程度與GAC病程的關系［n(%)］Table 2 The expression of Paxillin in different degrees of gastricmucosal lesions

3 討論

本研究結果顯示，Paxillin在CSG組中已有表達，且隨著胃黏膜病變程度的加重，表達逐漸增強，在GAC組中表達最強，59例GAC癌細胞胞質均呈彌漫性中等至強陽性著色，正常細胞為胞膜淡染，表明腺癌細胞中Paxillin不僅表達增高，而且在細胞內的分布和傳輸也發生了改變。由于Paxillin可與病毒癌基因v－Src蛋白、v－Crk蛋白和BCR/ABL癌性融合蛋白等多種致瘤性蛋白結合，擾亂、甚至誤導正常黏附和控制細胞增殖所需的生長因子信號級聯反應［6］，因此，GAC演化過程中Paxillin的表達異常可能是一種不可忽視的分子事件，其表達上調可能為組織惡性轉化的早期標志，且其影響可能持續至GAC階段。本研究結果顯示，中分化和低分化GAC組中Paxillin表達顯著高于高分化GAC組，田素芳等［7］在GAC中也觀察到同樣的結果，表明Paxillin作用持續到GAC階段，且與GAC的分化有一定的關系，但確切的作用機制尚有待于進一步研究。

本研究結果還發現，進展期和伴淋巴結轉移GAC組中Paxillin表達顯著高于早期和無淋巴結轉移GAC組。研究已發現，在高轉移潛能乳腺癌細胞中Paxillin在基因和蛋白水平的表達均高于低轉移潛能乳腺癌細胞，高轉移潛能乳腺癌細胞的黏附率高于低轉移潛能乳腺癌細胞［8］;肝細胞癌患者中Paxillin的陽性率在低分化組高于高分化組，伴有門靜脈癌栓形成組高于無癌栓形成組，伴有肝外轉移組高于無肝外轉移組［9］，與本研究相符，提示癌組織中Paxillin表達升高與GAC的轉移有關，可能使GAC細胞運動能力增強，與其周圍的非腫瘤細胞之間的局部黏附作用加強，腫瘤細胞更容易發生侵襲和遷移，進而形成轉移。

研究表明當Paxillin表達低下或缺失時，細胞形態變圓，影響細胞的扁平及絲狀偽足形成，細胞黏附能力下降，在培養基中擴散運動能力下降［10］。該基因缺失的成纖維細胞表現為細胞遷移能力缺陷，表明Paxillin具有控制細胞播散和移動的能力［2］。Paxillin過表達或磷酸化可使SCC25舌磷狀細胞癌細胞遷移、黏附能力增強［11］，使無侵襲性的乳腺癌細胞向有侵襲性表型轉化［4］。最新體外研究表明，胃癌細胞系的侵襲力與纖維連接蛋白和Paxillin酪氨酸118(tyr118)磷酸化呈正比，通過siRNA沉默Paxillin tyr118磷酸化，纖維連接蛋白刺激的該細胞系侵襲力也受抑制，Paxillin是纖維連接蛋白刺激胃癌細胞系侵襲的重要因子［12］。Chen等［13］發現乳腺腫瘤激酶Brk促進乳腺癌細胞系細胞的遷移和侵襲是Paxillin磷酸化引起的，Paxillin是Brk的結合蛋白和作用底物，EGF激活Brk的催化活性，Brk再磷酸化 Paxillin的 Y31和 Y118，通過適配蛋白(CrkII)激活鳥苷三磷酸酶Rac1(GTPase Rac1)，從而引起細胞侵襲和遷移。其絲氨酸磷酸化也參與細胞移動作用。肝細胞生長因子促進上皮細胞鋪展和遷移的過程是通過ERK磷酸化Paxillin的S83實現的［14］。抑制蛋白磷酸酶2A(PP－2A)導致Lewis肺癌細胞系細胞變圓、增加細胞的運動性，這過程中伴隨著Paxillin絲氨酸磷酸化增加和酪氨酸磷酸化減少［15］。Petit等［5］認為膠原蛋白誘導的NBT－II膀胱癌細胞的黏附和伸展均與Paxillin的酪氨酸磷酸化有關，如果把其分子中兩個最主要的酪氨酸Y31和Y118突變為苯丙氨酸并在細胞中過表達，則可以有效抑制細胞的運動，而細胞附著和鋪展并未受到影響。本研究在蛋白水平提示Paxillin可能參與GAC的侵襲和轉移，可能是GAC淋巴結轉移的預測指標，但具體的作用機制有待于進一步的深入研究。

也有研究顯示了不同的結果。大腸癌中Paxillin表達水平顯著高于配對的正常黏膜，而和轉移癌之間則無明顯差異［16］。siRNA阻斷黏著斑激酶 (focal adhesion kinase，FAK)和Paxillin的信號途徑導致HeLa細胞運動增強［17］。這些現象目前尚無肯定的解釋，可能與他們的實驗設計、組織存在差異、應用的細胞遷移基質不同等有關，也可能提示腫瘤細胞的轉移有比Paxillin更強的影響因素在起作用。Forest等［18］認為，Paxillin的表達和磷酸化水平取決于腫瘤細胞的組織類型。在不同腫瘤中表達和磷酸化不同可能是因為Paxillin在細胞中的作用具有組織和器官特異性。

1 Clark EA，Brugge JS.Integrins and signal transduction pathways:the road taken［J］.Science，1995，268(5208):233－239.

2 Schaller MD.Paxillin:a focal adhesion－associated adaptor protein［J］.Oncogene，2001，20(44):6459 －6472.

3 Iwasaki T，Nakata A，Mukai M，et al.Involvement of phosphorylation of Tyr31and Tyr118of paxillin in MM1 cancer cell migration［J］.Cancer，2002，97(3):330 －335.

4 Vadlamudi R，Adam L，Tseng B，et al.Transcripitional up －regulation of paxillin expression by heregulin in human breast cancer cells［J］.Cancer Res，1999，59(12):2843 －2846.

5 Petit VB，Boyer D，Lentz CE，et al.Phosphorylation of tyrosine residues 31 and 118 on paxillin regulates cell migration through an association with CRK in NBT － II cells［J］.Cell Biol，2000，148(5):957－970.

6 Turner CE.Molecules in focus paxillin ［J］.Cell Biol，1998，30(9):955－959.

7 田素芳，熊永炎，余少平，等.Paxillin在胃腺癌中的表達及臨床意義［J］.世界華人消化雜志，2003，11(10):1632－1634.

8 CAI Hui，ZHANG Tao，TANG Wei，et al.Fibronectin promotes tyrosine phosphory－lation of paxillin and cell invasiveness in the gastric cancer cell line AGS ［J］.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，41(1):91－94.

9 Li HG，Xie DR，Shen XM，et al.Clinicopathological significance of expression of paxillin，syndecan－1 and EMMPRIN in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2005，11(10):1445 －1451.

10 Hagel M，George EL，Kim A，et al.The adaptor protein paxillin is essential for normal development in the mouse and is a critical transducer of fibronectin signaling［J］.Mol Cell Biol，2002，22(3):901－915.

11 Conway WC，Vander Voortvan Zyp J，Thamilselvan V，et al.Paxillin modulates squamous cancer cell adhesion and is important in pressure－ augmented adhesion［J］.Cell Biochem，2006，98(6):1507－1516.

12 Li D，Ding J，Wang X，et al.Fibronectin promotes tyrosine phosphoryla－tion of paxillin and cell invasiveness in the gastric cancer cell line AGS ［J］.Tumori，2009，95(6):769－779.

13 Chen HY，Shen CH，Tsai YT，et al.Brk activates rac1 and promotes cell migration and invasion by phosphorylating paxillin ［J］.Mol Cell Biol，2004，24(24):10558 －10572.

14 Ishibe S，Joly D，Liu ZX，et al.Paxillin serves as an ERK －regulated scaffold for coordinating FAK and Rac activation in epithelial morphogenesis［J］.Mol Cell，2004，16(2):257－267.

15 Jackson JL，Young MR.Protein phosphatase－2A modulates the serine and tyrosine phosphorylation of paxillin in Lewis lung carcinoma tumor variants［J］.Clin Exp Metasasis，2002，19(5):409－415.

16 Ayaki M，Komatsu K，Mukai M，et al.Reduced expression of focal adhesion kinase in liver metastases compared with matched primary human colorectal adenocarcinomas ［J］.Clin Cancer Res，2001，7(10):3106－3112.

17 Yano H，Mazaki K，Kurokawa SK，et al.Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin－based cell－cell adhesion［J］.Cell Biol，2004，166(2):283 －295.

18 Forest V，Campos L，Vergnon JM，et al.Characterization of the focal adhesion complex in human non－small cell lung cancer cell lines［J］.Anticancer Res，2005，25(6):4135 －4139.