環氧合酶－2在胃癌淋巴結轉移灶中的表達及其與生存素和細胞核增殖抗原的關系

檀碧波，李 勇，韓 杰，范立僑，劉 羽，張志棟

在胃癌的發生發展中，環氧合酶－2(cyclooxygenase－2，COX－2)與腫瘤細胞的增殖、凋亡關系密切［1－2］，但這些研究多在原發灶或細胞系中進行，而對淋巴結轉移灶中COX－2的表達與腫瘤細胞增殖、凋亡的關系尚不明確。由于腫瘤演進過程中在多個方面出現異質性變化，研究轉移/殘留病灶中COX－2的表達與增殖和凋亡相關因子的表達，對針對轉移和(或)殘留病灶為目標的治療更具臨床意義。故本研究對胃癌原發灶及淋巴結轉移灶中COX－2的表達及其與生存素 (Survivin)、細胞核增殖抗原 (Ki－67)表達的關系進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年10月—2009年8月在我院手術并經病理證實伴淋巴結轉移的胃癌40例，其中男22例，女18例;年齡45～77歲，平均 (62.9±10.0)歲。患者術前均未接受放化療。每例腫瘤原發灶、相應淋巴結轉移灶標本均經中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片，經蘇木精－伊紅染色行病理診斷。

1.2 方法 采用免疫組化染色法 (SP法)分別對腫瘤原發灶和淋巴結轉移灶進行COX－2、Survivin、Ki－67染色，染色步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。用PBS代替一抗做陰性對照，用已知陽性切片做陽性對照。鼠抗人COX－2及Survivin、Ki－67單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購自北京中杉生物公司 (美國ZYMED公司產品)。

1.3 結果判斷 由兩位病理醫師分別雙盲閱片進行結果判斷。每張切片隨機取10個高倍視野 (×400)，每視野計數100個細胞，COX－2、Survivin以細胞膜和 (或)細胞質著染呈黃色為染色陽性，Ki－67以細胞核著染呈黃色為染色陽性。按腫瘤細胞著色強度和陽性細胞率分別進行記分;細胞增殖水平以Ki－67標記指數 (labeling index，LI)表示［3］。著色強度記分:無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。腫瘤細胞陽性細胞率記分標準:陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥76%為4分。兩種記分標準所得分值的乘積為0或1表示陰性 (－)，2～3為弱陽性 (+)，4～7為陽性 (++)，≥8為強陽性 (+++)。表達強度標準:記分≤3為弱表達，≥4為強表達。Ki－67 LI為計算出每張切片上的陽性表達百分數，即為Ki－67標記指數。

1.4 統計學方法 采用SAS8.0統計分析軟件進行統計檢驗。計數資料采用McNemar'sχ2檢驗，計量資料采用t檢驗，各指標間表達的相關性采用雙變量相關分析。p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌淋巴結轉移灶、原發灶間COX－2、Survivin、Ki－67表達強度比較 COX－2、Survivin在原發灶中強表達率分別為52.5%(21/40)、70.0%(28/40);在淋巴結轉移灶中強表達率分別為72.5%(29/40)、72.5%(29/40)。經Mc-Nemar'sχ2檢驗，COX－2在淋巴結轉移灶中的表達顯著高于原發灶，差異有統計學意義 (χ2=4，P=0.046);Survivin在兩種病灶中的表達強度比較差異無統計學意義 (χ2=0.0667，P=0.796，見表1)。原發灶中Ki－67 LI(58.9±22.4)顯著高于淋巴結轉移灶 (50.6±20.8)，差異有統計學意義 (t=－2.17，P=0.04)。

雙變量相關分析顯示，原發灶中COX－2的表達與淋巴結轉移灶中COX－2的表達呈正相關 (r=0.3484，P=0.0276);Ki－67 LI在兩種組織中的表達亦呈正相關 (r=0.5817，p＜0.0001);但兩種組織中Survivin的表達則無明顯相關性 (r=0.1816，P=0.262)。

2.2 原發灶與淋巴結轉移灶中COX－2表達與Survivin、Ki－67的關系 在原發灶中，COX－2的表達與Survivin、Ki－67的表達呈正相關 (r值分別為 0.6954和0.6084，P均 ＜0.0001);Survivin與Ki－67的表達也呈正相關 (r=0.6402，p＜0.0001)。淋巴結轉移灶中，COX－2的表達與Ki－67的表達呈正相關 (r=0.3350，P=0.035)，但COX－2與 Survivin、Survivin與Ki－67均無相關性 (r=0.2993，P=0.061;r= －0.0298，P=0.855)。

表1 COX－2、Survivin在胃癌原發灶及淋巴結轉移灶中的表達 (例)Table 1 The expression of COX－2，Survivin in primary tumor and lymph node metastases of gastric carcinoma

3 討論

胃癌的發生、侵襲、轉移、耐藥等生物學行為均與細胞增殖和凋亡失調密切相關。環氧合酶 (cyclooxygenase，COX)是一種膜結合蛋白，有COX－1和COX－2兩個亞型，而COX－2與腫瘤的發生、侵襲及淋巴結轉移的關系已得到部分證實［4］。Krysan等［5］研究發現，特異性的COX－2抑制劑能明顯減少Survivin的表達、腫瘤細胞凋亡增多;其他相關研究也證實COX－2表達與腫瘤細胞的增殖和凋亡有關［1，5］。本研究結果顯示，COX－2在胃癌淋巴結轉移灶中的表達與原發灶中的表達呈正相關，提示COX－2可能在胃癌的轉移過程中起作用;同時COX－2在淋巴結轉移灶中的表達強度顯著高于原發灶，表明胃癌淋巴結轉移灶中COX－2的表達已發生了異質性變化。由于腫瘤切除后復發的根源是殘留和 (或)轉移灶［6］，進展期胃癌淋巴結轉移率高達60%～80%，已成為影響預后的獨立因素，故研究淋巴結轉移灶中COX－2的表達具有重要意義。

Survivin可通過抑制Caspase阻止細胞凋亡，是目前已知分子量最小的凋亡抑制蛋白［7］，有強大的凋亡抑制作用。本研究發現，Survivin在胃癌淋巴結轉移灶中的表達強度與原發灶中的表達強度既無顯著差異，也無相關性，提示Survivin在原發灶、淋巴結轉移灶胃癌細胞的凋亡抵抗中發揮重要作用，可能成為胃癌生物治療的新靶點;同時結果也提示淋巴結轉移灶中Survivin的表達多發生了異質性變化，以原發灶中Survivin表達情況預測轉移灶中的表達是不準確的。分析COX－2與Survivin的關系發現，原發灶中COX－2與Survivin的表達呈正相關，而在淋巴結轉移灶中COX－2則與Survivin的表達則失去了這種關系。這說明COX－2可通過調控Survivin的表達抑制腫瘤細胞的凋亡;同時也表明淋巴結轉移灶與原發灶相比，諸多基因、大分子事件的異質性變化過程更為復雜，COX－2并非調控胃癌Survivin蛋白表達和功能的惟一因素，這一過程是多種與凋亡相關的基因/蛋白共同參與而實現的［8］。

Ki－67是反映細胞增殖的因子，是目前應用最廣泛、能準確反映增殖活性的指標［9－10］。本研究結果顯示，胃癌原發灶中Ki－67 LI顯著高于淋巴結轉移灶，說明胃癌淋巴結轉移灶的腫瘤細胞增殖活性低于原發灶，提示胃癌轉移過程中腫瘤的增殖活性與原發灶不同;結果還發現，兩種組織的Ki－67表達強度呈正相關，說明腫瘤轉移過程中Ki－67的變化可能存在一定規律性，但這種變化的具體情況及意義尚待繼續研究。Schmitz等［11］研究發現COX－2與腫瘤細胞的增殖有密切關系，本研究也發現COX－2與Ki－67在胃癌原發灶及淋巴結轉移灶中均表現出明顯的相關性，說明COX－2確與腫瘤細胞增殖有關，COX－2可能通過調控Ki－67來影響胃癌細胞的增殖活性。

本研究初步證實COX－2在胃癌淋巴結轉移灶中的表達與原發灶比較，已經出現異質性變化，且COX－2可能通過影響Survivin和Ki－67的表達來參與胃癌細胞的增殖、凋亡過程，故檢測淋巴結轉移灶中COX－2的表達對研究胃癌轉移過程中腫瘤細胞增殖、凋亡的變化有一定價值，但具體調控機制尚待進一步研究。

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