海康靈各組分抗神經細胞損傷有效部位和有效劑量的研究Δ

郭素，劉洪玲，孫偉，孫向紅#（1.青島大學，青島市 66003；.青島大學醫學院附屬醫院，青島市 66003）

海康靈合劑是在中醫理論指導下，在醫院協定處方“扶正液”基礎上加減藥味而成的臨床上治療阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的有效方劑。前期藥效學研究結果表明，海康靈對東莨菪堿所致AD模型動物學習記憶功能具有明顯的改善作用，其作用與抗氧化作用有關。為進一步研究其作用機制，筆者進行了拆方研究，通過拆方觀察比較新復方與原復方、新復方與單味藥對損傷神經細胞的影響，篩選出更為理想的量效關系，從而優化處方。

1 儀器與材料

1.1 儀器

倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Model550型酶標儀（美國BioRad公司）；KJWK-Ⅲ型微電腦凈化工作臺（青島康凈凈化消毒設備有限公司）；細胞培養箱（德國Heraeus公司）；生物安全柜（海爾集團特種電器有限公司）；80-2型離心沉淀器（金壇市國旺實驗儀器廠）。

1.2 試藥

海康靈，主要含有制何首烏、黃芪、黨參、靈芝、紅景天、川芎、當歸，生藥含量為1374 g·L-1，生藥材均由青島大學醫學院附屬醫院中草藥房提供并鑒定為真品；DMEM培養液（含HEPES 5958 mg·L-1；青霉素 100 IU·mL-1；鏈霉素 100 μg·mL-1）、無支原體胎牛血清（優級）均由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；PBS液、胰蛋白酶、30%過氧化氫（優級純，國藥集團化學制劑有限公司）；超純水、MTT（青島福林生物化學有限公司）；95%乙醇（山東酒精總廠藥用酒精廠）。

1.3 細胞

神經母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞株由瑞典卡洛林斯卡醫學院惠贈。

2 方法

2.1 實驗藥物的制備

將海康靈原方中單味藥材（黃芪150 g、制何首烏200 g、紅景天100 g、靈芝100 g、黨參100 g、川芎60 g、當歸60 g）分別按常規中藥煎煮方法煎煮2次，合并2次藥液濃縮至100 mL，離心除去雜質，加入30%乙醇沉淀12 h，過夜。上清液加熱濃縮至56 mL。用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，以原方濃度（濃度單位取mol·L-1）為基準梯度稀釋藥液（濃度單位取g·mL-1），4 ℃貯藏，備用。

2.2 SH-SY5Y神經細胞的培養

倒置相差顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞貼壁生長均勻，形態呈梭形、多觸角形。用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置37℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養，每3 d傳代1次。

2.3 篩選H2O2最佳成模濃度

將SH-SY5Y細胞按每孔5×103個接種至96孔板，細胞生長匯合率達70%～80%時，用含10%胎牛血清DMEM培養液換液，加入不同濃度的H2O2（終濃度分別為0、50、100、130、150、170、200 μmol·L-1，即為空白和H2O2①、②、③、④、⑤、⑥組），每個濃度設定平行的6孔，繼續培養24 h，每孔加5 g·L-1MTT20 μL，于37 ℃下、5%CO2保溫箱培養4 h，定量吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩后用酶標儀進行測定，于測定波長490 nm、參比波長630 nm波長處測定吸光度。以空白組的平均吸光度值為100%，其余各組均與之比較即得細胞存活率（細胞的存活率與其吸光度值呈正比）。

2.4 海康靈原方中單味藥材對H2O2損傷SH-SY5Y細胞模型存活率的影響

細胞培養方法同“2.3”項下方法操作，至96孔板細胞生長匯合率達70%～80%時，用含10%胎牛血清DMEM培養液換液，加入不同稀釋濃度的單味藥材藥液（即①、②、③、④組），每個濃度設定平行的3個孔，繼續培養24 h。每孔加入20 μL終濃度為150 μmol·L-1的H2O2，繼續培養24 h。另設空白、模型組。用MTT法測定細胞的存活率（細胞的存活率與其吸光度值呈正比）。

2.5 新復方與原復方、新復方與單味藥對H2O2損傷細胞模型存活率影響的比較

細胞培養方法同“2.3”項下方法操作，至96孔板細胞生長匯合率達70%～80%時，用含10%胎牛血清DMEM培養液換液，分別加入新復方（濃度為0.159 g·mL-1）、原復方（濃度為0.137 g·mL-1）和單味藥（黃芪0.268 g·mL-1、制何首烏0.375 g·mL-1、靈芝 0.358 g·mL-1、黨參 0.268 g·mL-1、川芎 0.193 g·mL-1、當歸0.161 g·mL-1）的藥液，每種藥液設定平行的3個孔，繼續培養 24 h。每孔加入 20 μL 終濃度為 150 μmol·L-1的H2O2，繼續培養24 h。用MTT法測定細胞的存活率（細胞的存活率與其吸光度值呈正比）。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 不同濃度H2O2對SH-SY5Y神經細胞活性的影響

SH-SY5Y細胞經H2O2處理后對MTT的攝取能力下降，吸光度值顯著低于空白組，表明細胞受到了損傷或部分細胞已經死亡；在50～200 μmol·L-1濃度范圍內，隨H2O2濃度的增加，細胞的存活率呈梯度下降；與空白組比較，50～130 μmol·L-1組有顯著性差異（P＜0.05），150 μmol·L-1以上濃度有極顯著性差異（P＜0.01），故選擇150 μmol·L-1H2O2作為最佳復制模型濃度。不同H2O2濃度對細胞存活率的影響見表1。

表1 不同H2O2濃度對細胞存活率的影響（±s，n＝6）Tab 1 Influence of Different density of H2O2on cell survival percentage（±s，n＝6）

表1 不同H2O2濃度對細胞存活率的影響（±s，n＝6）Tab 1 Influence of Different density of H2O2on cell survival percentage（±s，n＝6）

與空白組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白組H2O2①組H2O2②組H2O2③組H2O2④組H2O2⑤組H2O2⑥組抑制率/%12.426.236.839.840.846.151.6濃度/μmol·L-1 050100130150170200吸光度值0.876±0.0160.738±0.023＊0.632±0.038＊0.602±0.041＊0.592±0.021＊＊0.539±0.059＊＊0.484±0.037＊＊

3.2 海康靈中不同濃度單味藥對H2O2損傷SH-SY5Y細胞存活率的影響

3.2.1 不同濃度黃芪、制何首烏、靈芝、紅景天藥液對H2O2損傷SH-SY5Y細胞存活率的影響 SH-SY5Y細胞預先用4種不同濃度的黃芪藥液、制何首烏藥液、靈芝藥液、紅景天藥液孵育24 h，與模型組細胞比較，其測得的吸光度值有所變化。其中，黃芪4種濃度藥液處理后，其測得的吸光度值顯著增大（P＜0.05），說明這4種濃度的藥物對細胞具有明顯的保護作用，故選擇吸光度值最高的藥液濃度（0.268 g·mL-1）為新組方濃度；制何首烏4種濃度藥液處理后，其測得的吸光度值顯著增大（P＜0.05），說明這4種濃度的藥物可明顯減輕H2O2對細胞造成的損傷，故選擇吸光度值最高的藥液濃度（0.375 g·mL-1）；靈芝4種濃度藥液處理后，與模型組比較，隨濃度的增大，吸光度值也逐漸增大，與其他藥物組比較0.358 g·mL-1濃度吸光度值最高（P＜0.05），說明靈芝0.358 g·mL-1濃度比其他濃度藥物組對細胞具有更顯著的保護作用，故選擇0.358 g·mL-1藥物組；紅景天4種濃度藥液處理后，其測得的吸光度值均減小，說明此濃度范圍的紅景天藥液對細胞并無顯著的保護作用，故暫不做選擇。不同濃度黃芪、何首烏、靈芝、紅景天藥液對細胞存活率的影響見表2。

表2 不同濃度黃芪、何首烏、靈芝、紅景天藥液對細胞存活率的影響（±s，n＝3）Tab 2 Influence of different concentrations of the liquids of Astragalus membranaceus，Polygonum multiflorum，Ganoderma，Rhodiola crenulata on survival rate of cells（±s，n＝3）

表2 不同濃度黃芪、何首烏、靈芝、紅景天藥液對細胞存活率的影響（±s，n＝3）Tab 2 Influence of different concentrations of the liquids of Astragalus membranaceus，Polygonum multiflorum，Ganoderma，Rhodiola crenulata on survival rate of cells（±s，n＝3）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別空白組模型組黃芪①組黃芪②組黃芪③組黃芪④組靈芝①組靈芝②組靈芝③組靈芝④組何首烏①組何首烏②組何首烏③組何首烏④組紅景天①組紅景天②組紅景天③組紅景天④組吸光度值0.7061±0.01030.5524±0.02215＊0.7790±0.03217#0.7224±0.02401#0.7427±0.0309#0.7553±0.0308#0.6381±0.03160.7002±0.01891#0.7395±0.04153#0.7807±0.03402#0.6897±0.071#0.6718±0.027#0.6540±0.0211#0.5611±0.0857#0.4737±0.05500.5494±0.026210.5197±0.043930.4578±0.02336濃度/g·mL-1- -0.2680.4020.4820.5360.1790.2680.3220.3580.3750.5360.6430.7140.1790.2680.3220.358

3.2.2 不同濃度黨參、川芎、當歸藥液對H2O2損傷SH-SY5Y細胞存活率的影響 SH-SY5Y細胞預先用不同濃度的黨參藥液、川芎藥液、當歸藥液孵育24 h，與模型組細胞比較，其測得的吸光度值有所變化。其中，黨參藥液處理后，0.268 g·mL-1藥物組吸光度值較其他濃度組高，故選擇0.268 g·mL-1藥物組；川芎4種濃度藥液處理后，0.193 g·mL-1藥物組吸光度值較其他組高，故選擇0.193 g·mL-1藥物組；當歸4種濃度藥液處理后，0.193 g·mL-1藥物組吸光度值較其他組高（P＜0.05），故選擇0.193 g·mL-1藥物組。不同濃度黨參、川芎、當歸藥液對細胞存活率的影響見表3。

表3 不同濃度黨參、川芎、當歸藥液對細胞存活率的影響（±s，n＝3）Tab 3 Influence of different concentrations of the liquids of Codonopsis Radix，Ligusticum chuanxiong，Angelica sinensis on survival rate of cells（±s，n＝3）

表3 不同濃度黨參、川芎、當歸藥液對細胞存活率的影響（±s，n＝3）Tab 3 Influence of different concentrations of the liquids of Codonopsis Radix，Ligusticum chuanxiong，Angelica sinensis on survival rate of cells（±s，n＝3）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

吸光度值0.6916±0.051960.4887±0.05802＊0.5803±0.04807#0.5974±0.05444#0.5664±0.038970.4690±0.04290.5479±0.04810.6771±0.0363#0.7146±0.01014#0.6252±0.0797#0.7114±0.022960.7966±0.013060.8566±0.07783##0.8216±0.03522#組別空白組模型組黨參①組黨參②組黨參③組黨參④組當歸①組當歸②組當歸③組當歸④組川芎①組川芎②組川芎③組川芎④組濃度/g·mL-1- -0.1790.2680.3220.3580.1070.1610.1930.2140.1070.1610.1930.214

3.3 新復方與原復方、新復方與單味藥對H2O2損傷細胞模型存活率影響的比較

新復方組的吸光度值明顯比原復方組和其他單味藥組高（0.7813），說明新復方組比原復方組和其他單味藥組對神經細胞更具有保護作用，對受損的神經細胞具有明顯的修復作用。新復方與原復方、新復方與單味藥對細胞存活率影響的比較見表4。

表4 新復方與原復方、新復方與單味藥對細胞存活率影響的比較（±s，n＝3）Tab 4 Comparison of the effects of new formula vs.original one and new formula vs.single ingredient on survival rate of cells（±s，n＝3）

表4 新復方與原復方、新復方與單味藥對細胞存活率影響的比較（±s，n＝3）Tab 4 Comparison of the effects of new formula vs.original one and new formula vs.single ingredient on survival rate of cells（±s，n＝3）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別空白組模型組新復方組原復方組黃芪組制何首烏組靈芝組黨參組川芎組當歸組吸光度值0.6338±0.01530.4883±0.0084＊0.7813±0.02509#0.6328±0.02473#0.6211±0.0236#0.4926±0.024050.6913±0.0403#0.4938±0.02960.6094±0.03813#0.5658±0.0774#濃度/g·mL-1- -0.1590.1370.2680.3750.3580.2680.1930.161

4 討論

AD是一種中樞神經系統退行性疾病，臨床主要表現為認知功能障礙、行為異常及日常生活能力下降，主要神經病理改變有神經元變性、丟失引起的腦萎縮，細胞外的老年斑（Senile plaque，SP）和細胞內的神經元纖維纏結（Neurofibrillary tangle，NFT）[2，3]。近年來越來越多的證據顯示，多種神經退行性病變與氧化應激密切相關[4]。

目前，大量的相關實驗證實，在治療老年性癡呆的各類藥物中，中藥復方因其具有療效好、副作用少、兼顧面廣、能長期服用等優勢，越來越受到人們的重視。本次實驗在前期研究的原有復方的基礎上，為進一步研究其作用機制，篩選出較為理想的量效關系，進行了拆方后重新組方的研究，采用體外神經細胞（SH-SY5Y）培養，MTT比色分析的方法進行。研究發現，SH-SY5Y細胞預先用0.268 g·mL-1濃度的黃芪藥液、0.375 g·mL-1濃度的制何首烏藥液、0.358 g·mL-1的靈芝藥液、0.268 g·mL-1濃度的黨參藥液、0.193 g·mL-1濃度的川芎藥液和0.193 g·mL-1濃度的當歸藥液孵育后，能有效拮抗H2O2造成的細胞損傷（P＜0.05），細胞存活率顯著升高。

原方拆方后，篩出的濃度劑量更加合理：黃芪0.268 g·mL-1、制何首烏0.375 g·mL-1、靈芝0.358 g·mL-1（原方為0.179 g·mL-1）、黨參0.268 g·mL-1（原方為0.179 g·mL-1）、川芎0.193 g·mL-1（原方為 0.107 g·mL-1）、當歸 0.193 g·mL-1（原方為0.107 g·mL-1）、紅景天不做選擇。依照此濃度劑量重新組成的復方與原復方和單味藥的最佳濃度劑量組對神經細胞的作用比較，新復方具有明顯的優勢，進一步說明單味中藥在治療中是有局限性的，中藥復方是中醫辯證論治、理法方藥等理論的具體體現。中藥復方的應用，既不是藥物作用在數量上的簡單相加，也不是毒副反應相互間機械地抵銷，而是通過藥物合理配伍產生出整體綜合效應，符合傳統中醫藥理論和多組分、多靶點、多效應的現代理論[5]。與單純的化合物比較，中藥在AD的防治方面具有更大的潛力[6]。

總之，本次拆方研究為下一步的臨床應用提供了理論依據，優化后的處方將會應用于臨床來驗證其療效。

[1]張 艷，陶根魚.Alzheimer’s病病因學及發病機制的研究進展[J].陜西中醫函授，2001，3：40.

[2]Ricardo B，Maccionil，Cristobal B，et al.Biological markers of Alzheimer’s disease and mild cog-nitive impairment[J].Current Alzheimer Research，2004，16（1）：307.

[3]Nirvana S，Girish J.Molecular mechanisms，emerging etiological insights and models to test potential therapeutic interventions in Alzheimer’s disease[J].Current Alzheimer Research，2004，16（1）：295.

[4]張均田.老年癡呆的發病機制及治療策略EJ-1[J].藥學學報，2000，35（5）：368.

[5]羅國安，王義明.中藥復方物質基礎和藥效相關性研究[J].世界科學技術-中藥現代化，1999，1（1）：11.

[6]朱海升，劉鄂湖.抗老年性癡呆的天然藥物研究進展[J].中國藥房，2007，18（3）：225.