菩人丹超微粉對糖尿病大鼠視網膜VEGF蛋白表達的影響Δ

王海彬，王東華，張鐵民（承德醫學院附屬醫院眼科，承德市 067000）

糖尿病視網膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病微血管病變在眼部的重要并發癥[1]。從中醫學角度講，其發病辨證為陰虛為本、血瘀為標，治以益氣養陰、活血化瘀類中藥，臨床上可取得較好效果。本課題組利用糖尿病模型大鼠的視網膜石蠟切片進行免疫組化研究，觀察了血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白在不同組別的表達情況，旨在研究菩人丹超微粉在早期DR治療中的作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

E600型光學顯微鏡（日本尼康公司）；ONE TOUCH血糖儀（強生（中國）有限公司）。

1.2 試藥

人參、丹參、制何首烏、葛根、水蛭均由河北省承德醫學院附屬醫院中藥房提供，由河北省承德醫學院附屬醫院王東華主任藥師鑒定為真品；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；苦瓜由筆者購買。

1.3 動物

健康Wistar大鼠60只，♂，體重150～200 g，由中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SCXK（津）2005-0001）。

2 方法

2.1 復制模型

將STZ溶于0.05 mol·L-1檸檬酸緩沖液（pH 4.5），制備成濃度為1.25%的溶液，隨機選取50只大鼠，ip STZ 60 mg·kg-1以誘發糖尿病，另外10只作為正常組，僅ip同樣體積的檸檬酸緩沖液，注射3 d后用血糖儀測血糖，用尿糖試紙測尿糖濃度，以血糖＞16.5 mmol·L-1、尿糖（++++）、尿量以及飲水明顯增多者作為實驗對象。

2.2 菩人丹超微粉的組方和制備工藝

2.2.1 組方 苦瓜原汁10 kg，人參1 kg，丹參3 kg，制何首烏1 kg，葛根1 kg，水蛭0.3 kg。

2.2.2 制備工藝 苦瓜原汁10 kg，過濾，減壓濃縮到0.6 kg；人參、丹參，粗碎成5 mm左右顆粒，加10倍水回流提取3次，時間為2、1.5、1 h，濃縮；葛根、制首烏加10倍量70%乙醇回流提取2次，時間為1.5、1 h，濃縮；水蛭加10倍量90%乙醇回流提取2次，時間為2、1.5 h（提取溫度控制在60℃），濃縮。合并上述提取液，噴霧干燥，即得。共提取超微粉2.0 kg。

2.3 分組和給藥

實驗分為3組，即正常（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、菩人丹超微粉（15 mL·kg-1）組，ig給藥，每天1次，連續5個月，定期測血糖、尿糖和體重。5個月后輕摘眼球，留做實驗。

2.4 取材、固定和石蠟切片制作

ig 5個月后斷頸處死大鼠，處死后立即取出眼球，固定于10%福爾馬林中，48 h后常規石蠟包埋，連續4 μm切片用于免疫組化染色和HE染色。

2.5 免疫組化染色

通過脫蠟、脫水，組織修復、滴加抗體，復染，封片等完成免疫組化染色，其中抗體濃度為1∶200。

2.6 結果的測定

利用血糖儀分別測量在復制模型成功時和1個月、3個月、5個月時的各組大鼠血糖值。采用光學顯微鏡及其照相系統，對結果進行觀察并照相進行比較。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 免疫組化結果

正常組VEGF的免疫組化無陽性表達，視神經感覺層各層均未見到明顯染色。模型組VEGF的免疫組化出現陽性的表達，外界膜、外叢狀層、內核層、內叢狀層以及視神經節細胞層均出現極棕色的染色，且染色的程度較實驗組強，面積較正常組大，外核層靠近外界膜處也出現染色現象；內核層細胞間隙增大，細胞水腫明顯，細胞形態改變。菩人丹超微粉組VEGF的免疫組化出現弱陽性改變。免疫組化圖見圖1；菩人丹超微粉對于糖尿病模型大鼠視網膜病變中VEGF蛋白表達的影響見表1。

圖1 免疫組化圖片A.正常組；B.模型組；C.菩人丹超微粉組Fig 1 Immunol histochemistry picturesA.normal group；B.model group；C.Purendan ultrafine powder group

3.2 不同時間點血糖值測定結果

表1 菩人丹超微粉對糖尿病模型大鼠視網膜病變中VEGF蛋白表達的影響Tab 1 Effects of Purendan ultrafine powder on the expression of VEGF in retina of diabetic rats

正常組血糖正常；模型組血糖顯著升高（P＜0.01）；菩人丹超微粉組血糖值顯著降低（P＜0.01）。菩人丹超微粉對糖尿病大鼠不同時間點血糖值的影響見表2。

表2 菩人丹超微粉對糖尿病大鼠不同時間點血糖值的影響Tab 2 Effects of Purendan ultrafine powder on the level of blood glucose in diabetic rats at different time points

4 討論

現代研究證明，VEGF在DR的發生、發展及轉歸中起著重要的作用[2，3]。視網膜上多種細胞均可以產生VEGF，作用于血管后促進其內皮細胞分裂，最終形成新生血管；VEGF使微血管內皮細胞通透性增強，大分子物質如纖維蛋白原等進入細胞外基質中形成纖維蛋白凝膠[4]，減慢血流速度增加血液黏稠度，增加血管堵塞的幾率。VEGF與DR之間存在著正相關的關系[5]。因此，通過觀察視網膜組織中的VEGF染色情況可以反過來判斷疾病的發病程度以及用藥治療后的療效。

本研究結果表明，在5個月觀察時，菩人丹超微粉組大鼠的視網膜病理切片免疫組化染色較模型組明顯要弱，從微觀上證明中藥菩人丹超微粉在治療DR上確實是有效的。

ig給藥5個月后，內核層的染色相對于外核層次無論在治療組還是對照組均較強，究其原因筆者認為是該層主要由雙極細胞、Müller等的細胞核構成，在DR時這一層可以通過自分泌或旁分泌產生大量VEGF[6]，從而出現以上結果，這與曾凱宏等[7]的研究結果是一致的；對照組外核層也出現了VEGF的顯色，可能是由于神經細胞在視網膜中的耗氧量最大，因此對缺氧相對更敏感造成的[8]。

DR屬中醫“內障”的范疇，很多醫家認為其病因病機是先天稟賦不足，后天調養失調，導致肝腎陰虛、陰虧燥熱、耗精灼液、血稠成瘀、脈絡不通、精氣不能上榮于目而致，氣陰虧虛是本，氣滯血瘀是標，以“滋陰清熱、活血通絡”之法治之[9]。中藥菩人丹以人參、丹參、葛根益氣生津和活血化瘀；苦瓜清解郁熱；制何首烏補益精血、固腎益陰；水蛭祛瘀消、剔邪搜絡。諸藥協同有益氣養陰、調暢氣血、化瘀通絡之功。

現代藥理研究表明，人參含有多種化學成分，主要有人參皂苷、人參多糖、多肽、人參炔醇、麥芽酚、腺嘌呤核苷以及某些氨基酸和微量元素等，具有降低血糖、減輕體重、調節血脂、改善凝血功能等功能[10，11]。苦瓜含有三萜類-苦瓜皂苷、甾類-苦瓜苷等，具有降低血糖，抗氧自由基抑制β細胞凋亡作用[12]。丹參通過抗氧化作用抵抗自由基造成的內皮細胞損傷，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，下調丙二醛（MDA）含量從而對血管內皮起到保護作用[13]。葛根對具有改善血管內皮功能作用和改善微循環的作用[14]。近年的許多研究發現，水蛭及其唾液中含有多種活性成分，包括水蛭素、組胺樣物質、蛋白質、抗血栓素等。水蛭素有拮抗凝血酶強抗凝作用，也可抑制凝血酶對內皮細胞刺激誘導血管生成的作用，是凝血酶的特異性抑制劑[15]。諸藥合用具有降血糖，促使胰島細胞的恢復，保護血管內皮，防止血栓形成和抗氧化，改善視網膜微循環，改善視網膜缺氧狀態的作用。

本研究證實，VEGF在糖尿病大鼠模型的視網膜中確實出現了陽性的表達，而且各個層次表達不一。中藥菩人丹超微粉可以有效抑制其表達，從而起到延緩或治療DR的作用，并證實了該中藥的有效性，可為臨床進一步研究奠定理論基礎。

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