布渣葉抗內(nèi)毒素和急性毒性實驗研究Δ

梅全喜，戴衛(wèi)波，范文昌，曾聰彥，鐘希文（廣州中醫(yī)藥大學附屬中山醫(yī)院，中山市 528400）

布渣葉為椴樹科植物破布葉Microcos paniculata L.的干燥葉，最早見于清·何克諫所著的嶺南本草書籍《生草藥性備要》（公元1717年），該書載其：“味酸，性平，無毒，解一切蠱脹，清黃氣，消熱毒。[1]”《本草綱目拾遺》（公元1765年）引《廣東通志》云：“從肇慶新橋而上，人煙寥落，山路多歧，乃三縣交界之區(qū)。舟人及此險地，即燃夢香，客皆酣臥昏迷，遂被啟，易貲財以礫塊，封識宛然，若枕間置水一盂，則迷藥皆渙散矣，又有藥名破布葉，可解。行者歌曰：身無破布葉，莫上夢香船。”又引《肇慶志》曰：“破布葉出陽江陽春恩平，狀如掌而綠，嶺南舟人多用香煙及毒水迷悶過客，以此草煎湯服之，立解。[2]”其后的《嶺南草藥志》、《陸川本草》及兩廣地區(qū)的中草藥手冊對此均有記載。自古以來，布渣葉就在嶺南地區(qū)的民間廣泛應用，民間常用布渣葉煎茶作夏季飲料，有解渴、開胃作用[3]，并認為其無毒。臨床上亦常用本品治療消化系統(tǒng)類疾病，均未見有毒副作用報道。然布渣葉的毒性如何，一直缺乏實驗研究驗證，本研究進行急性毒性和抗內(nèi)毒素實驗，對布渣葉急性毒性和解毒作用進行研究，以期為本品安全、合理使用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥

布渣葉，購于廣東廣弘藥材有限公司，經(jīng)廣東省中山市藥檢所鑒定為真品；地塞米松（上海易利生物科技有限公司，批號：20100418）；大腸桿菌O55B5內(nèi)毒素（上海申索試劑有限公司）；生理鹽水、蒸餾水均由廣州中醫(yī)藥大學附屬中山醫(yī)院制劑室自制。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，♀♂兼半，體重（20±2）g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK（粵）2008-0002）。根據(jù)實驗性質(zhì)和性別分籠喂養(yǎng)，自由采食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計學方法

抗內(nèi)毒素實驗數(shù)據(jù)用Fisher’s exact test取雙側(cè)檢驗值；急性毒性實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0概率單位法統(tǒng)計分析（Probit Analysis）；P＜0.05為有顯著性統(tǒng)計學差異，P＜0.01為有非常顯著性統(tǒng)計學差異。

2.2 抗內(nèi)毒素實驗

2.2.1 布渣葉水提物的制備 取布渣葉粗粉1 kg，加水浸泡1 h，煎提2次，過濾，合并濾液，濃縮成500 mL，即2 g（生藥）·mL-1。加防腐劑，貯藏于冰箱中，臨用前配制成所需濃度。

2.2.2 實驗方法 取小鼠60只，♀♂兼半。隨機均分為6組，即空白對照（等容量生理鹽水）、模型（等容量生理鹽水）和布渣葉水提物高、中、低劑量（23.4、11.7、5.58 g·kg-1）組，ig給藥，連續(xù)7 d；地塞米松（0.02 g·kg-1）組于給藥末次當日im給藥。于末次給藥后1.5 h，除空白對照組ip等容量的生理鹽水外，其余各組小鼠均ip大腸桿菌O55B5內(nèi)毒素60 mg·kg-1，觀察并記錄各組小鼠在注射內(nèi)毒素或生理鹽水后3 h內(nèi)的形態(tài)變化（是否出現(xiàn)聳毛、發(fā)抖、蜷縮、拒食、瞼膜充血、舌質(zhì)偏出，耳緣及皮下是否出現(xiàn)出血、斑點）和72 h內(nèi)的生存狀況。布渣葉水提物抗內(nèi)毒素作用見表1。

結(jié)果，空白對照組小鼠活動自如。模型和各用藥組ip大腸桿菌O55B5內(nèi)毒素1 h內(nèi)，各組小鼠均活動自如。12 h后布渣葉水提物低劑量組、模型組有部分小鼠死亡，模型組、地塞米松組、布渣葉水提物高、中、低劑量組小鼠均出現(xiàn)聳毛、煩躁不安、顫抖、蜷縮及眼瞼充血等現(xiàn)象。注射后的第3天，布渣葉水提物低劑量組存活小鼠狀態(tài)均有好轉(zhuǎn)，模型組小鼠還是出現(xiàn)煩躁不安、顫抖、蜷縮等癥狀，地塞米松組小鼠活動自如。布渣葉水提物高、中劑量組與模型組比較，對減少ip大腸桿菌O55B5內(nèi)毒素所致小鼠死亡數(shù)有顯著性意義（P＜0.05），其死亡率分別為20%、20%。結(jié)果表明，布渣葉水提液具有抗內(nèi)毒素休克死亡作用。

表1 布渣葉水提物抗內(nèi)毒素作用Tab 1 Anti-endotoxic effects of aqueous extract of F.microcotis

2.3 急性毒性實驗

2.3.1 藥物的制備 布渣葉粗粉1350 g，布口袋包扎后用冷水浸泡1 h，水量以浸沒藥材為度。放入提取罐中煎煮3次，每次1 h。合并提取液，4℃冰箱中冷藏24 h，過濾。濾液濃縮至220 mL，即6.136 g·mL-1，冷藏，備用，用時稀釋至所需濃度。

2.3.2 預實驗 小鼠每組4只，♀♂兼半，以藥物的最大ig濃度（藥物能順利通過ig針頭的最大藥物濃度）為起始濃度，1∶0.5濃度梯度往下稀釋，ig體積均為35 mL·kg-1，ig給藥前禁食不禁水約12 h，藥后正常飼養(yǎng)，密切觀察動物狀況，摸索出藥物最大致死量（Dm）和藥物最小致死量（Dn）。經(jīng)實驗表明，布渣葉水提物最大ig濃度為214.76 g·kg-1，Dm＝150.33 g·kg-1，Dn＝47.25 g·kg-1。

2.3.3 正式實驗[4]在Dm和Dn間以1∶0.75梯度稀釋，分為5組，每組10只，♀♂兼半，ig體積均為35 mL·kg-1，ig給藥前禁食不禁水約12 h，藥后正常飼養(yǎng)，連續(xù)7 d密切觀察小鼠狀況并紀錄。布渣葉水提物急性毒性實驗結(jié)果見表2。

表2 布渣葉水提物急性毒性實驗結(jié)果Tab 2 Acute toxic experiment of aqueous extract of F.microcotis

經(jīng)SPSS13.0概率單位法統(tǒng)計分析（Probit Analysis），布渣葉小鼠半數(shù)致死量（LD50）＝91.76 g·kg-1，此LD50的95%可信區(qū)間為77.28～108.85 g·kg-1。經(jīng)解剖觀察，死亡小鼠的心、肝、腎、脾等內(nèi)臟器官肉眼觀察未見病理變化，而部分死亡小鼠僅見胃有脹氣現(xiàn)象。

3 討論

內(nèi)毒素是革蘭陰性細菌細胞壁外膜的組成成分，由細菌死亡后細胞壁裂解釋放。內(nèi)毒素主要成分為脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），是細菌致病的主要物質(zhì)，在多種危急重癥中起著重要作用，如發(fā)熱反應、感染性休克、白細胞反應，多器官功能衰竭及彌散性血管內(nèi)凝血等。內(nèi)毒素還有免疫激活作用，可引起機體免疫損傷。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多中藥具有抗內(nèi)毒素作用，如大青葉、甘草、金銀花、連翹等。其作用機制有清除或滅活內(nèi)毒素，減弱或消除內(nèi)毒素誘發(fā)活性因子的損傷及對臟器組織細胞的保護作用[5]。本研究結(jié)果表明，布渣葉水提物可顯著減少內(nèi)毒素所致動物死亡數(shù)，表現(xiàn)出良好的抗內(nèi)毒素休克死亡作用，這正與布渣葉自古以來就當作清熱解毒良劑相印證。另有研究表明，本品有清除自由基[6]、抗衰老和延長缺氧鼠存活時間等作用[7]。由此提示，本品抗內(nèi)毒素作用機制可能與減弱或消除內(nèi)毒素誘發(fā)的活性因子的損傷及對臟器組織細胞的保護作用有關，具體有待于進一步研究。

布渣葉毒性方面，自《生草藥性備要》最早載其“無毒”以來，之后書籍也均載其“無毒”或未提及，文獻中也未見有關其毒性或不良反應的報道。布渣葉也是王老吉等多個涼茶配方的組成藥味，在《十余年來王老吉涼茶，食品安全毒理學評價結(jié)果的報告》一文中，報道了布渣葉提取液和布渣葉浸膏的小鼠急性毒性LD50＞21.5 g·kg-1，進行小鼠骨髓微核實驗、小鼠精子畸形實驗和Ames實驗結(jié)果均為陰性，進行的大鼠致畸實驗結(jié)果也為陰性，進行的大鼠90 d急性毒性實驗結(jié)果也表明各項指標正常。本研究中，布渣葉水提物小鼠的急性毒性LD50為91.76 g·kg-1，2010年版《中國藥典》載布渣葉用量為15～30 g，如以成人體重70 kg、日服用劑量30 g計算，則此LD50值相當于臨床劑量的214倍。有文獻認為，LD50＞10.00 g·kg-1則可確認為實際無毒物[8]。由此可認為布渣葉在2010年版《中國藥典》推薦劑量下使用是安全的。而對死亡和存活小鼠的心、肝、腎、脾等內(nèi)臟器官解剖，肉眼觀察未見病理變化，僅部分死亡動物胃有見脹氣現(xiàn)象。本實驗由于受經(jīng)費限制未能從病理方面對死亡原因進行探討。

[1]清·何克諫著，朱曉光點注.生草藥性備要（嶺南本草古籍3種）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1999：32.

[2]清·趙學敏.本草綱目拾遺[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，1998：240.

[3]曾聰彥，梅全喜.布渣葉的藥用歷史及現(xiàn)代研究概述[J].中國藥房，2008，19（增刊）：25.

[4]陳 奇.中藥藥理研究方法學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：113.

[5]孫耀光.中藥抗內(nèi)毒素的作用及其機制[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2004，24（6）：40.

[6]潘天玲，李坤平，林贊菲，等.不同產(chǎn)地布渣葉總黃酮含量及其清除自由基活性研究[J].廣東藥學院學報，2009，25（5）：452.

[7]曾聰彥，梅全喜，戴衛(wèi)波.布渣葉藥理作用研究的新進展[J].中華中醫(yī)藥學刊，2010，28（9）：1927.

[8]李建華.中藥類急性毒性技術法與LD50值的分級[J].中草藥，1994，25（7）：388.