異蓮心堿在大鼠體內的藥動學研究

陳俊萍，李向陽（1.西寧市第二人民醫院，西寧市 810003；.青海大學醫學院，西寧市 810001）

異蓮心堿（Isoliensine）為睡蓮屬植物蓮Nelumbo nucifer Gaertu的綠色胚芽中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有抗心律失常、降壓以及改善心血管功能等生物活性[1，2]。目前有關異蓮心堿的報道多集中于藥效學，對該藥藥動學研究較少。本研究旨在采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定大鼠靜脈給予單劑量異蓮心堿后血藥濃度的變化，并探討其藥動學特點，為該藥的臨床前研究和評價以及今后的臨床研究提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC儀，包括G1322A二極泵、G1315B二級管陣列檢測器、G1316A色譜柱恒溫箱、HP1100色譜工作站和G1329自動進樣系統（美國安捷倫公司）；TDL-5型低溫離心機（上海安亭醫療器械公司）；YKH型渦旋混合器（江西醫療器械公司）；KQ-250B型超聲清洗器（江蘇昆山超聲波儀器有限公司）；BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.2 試藥

異蓮心堿標準品（深圳美荷生物科技有限公司，批號：20080203，含量≥98.0%）；蝙蝠葛堿標準品（武漢遠誠生物科技有限公司，批號：20070626，含量：≥98.0%）；甲醇和乙腈為色譜純，三乙胺、甲基叔丁基醚均為分析純，水為重蒸餾水。

1.3 動物

Wistar大鼠，♀♂兼半，體重（220±30）g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供（動物合格證號：SCXK（京）11-00-0006）。

2 方法與結果[3]

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.05 mol·L-1KH2PO4＝22∶38∶40（三乙胺調pH值至7.5）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 異蓮心堿標準品溶液 精密稱取異蓮心堿標準品12.50 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.50 mg·mL-1的異蓮心堿標準品貯備液。精密吸取該標準品貯備液適量，分別稀釋定容至10 mL，配成濃度分別為10.00、25.00、50.00 μg·mL-1的系列溶液，4 ℃貯藏，備用。

2.2.2 蝙蝠葛堿標準品溶液 精密稱取蝙蝠葛堿標準品2.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得20.0 μg·mL-1的蝙蝠葛堿標準品貯備液，4℃貯藏，備用。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取離心后的大鼠血漿100 μL，置具塞玻璃試管中，加入3.0 mL甲基叔丁基醚，渦旋30 s，12000 r·min-1離心5 min，轉移全部上清液于40℃N2吹干，殘渣用100 μL流動相復溶，取50 μL進樣分析。

2.4 方法專屬性考察

空白血漿、空白血漿加入異蓮心堿標準品和靜脈給予異蓮心堿后的血漿樣品，按照“2.3”項下方法操作，進樣分析。結果，異蓮心堿和內標蝙蝠葛堿的保留時間分別約為6.5 min和11.0 min，分離度為3.50，峰形尖銳，無拖尾現象。相應的理論板數＞5000，血漿中的內源性物質不干擾體內異蓮心堿含量測定。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿加入異蓮心堿標準品；C.iv異蓮心堿30 min血漿樣品；1.異蓮心堿；2.蝙蝠葛堿Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma mixed with isoliensine；C.plasma sample 30 min after intravenous injection of isoliensine；1.isoliensine；2.dauricine

2.5 標準曲線的制備

精密吸取異蓮心堿對照品溶液適量，加入空白血漿100 μL，配成異蓮心堿濃度分別為0.50、2.00、5.00、10.00、15.00、25.00、40.00 μg·mL-1的血漿樣品，按照“2.3”項下方法操作。以異蓮心堿和蝙蝠葛堿的峰面積比值（A）對血漿中異蓮心堿濃度（c）進行線性回歸，得回歸方程為A＝63.043c+3.937（r＝0.9998）。結果表明，異蓮心堿檢測濃度在0.50～40.00 μg·mL-1范圍內與異蓮心堿和蝙蝠葛堿的峰面積比值呈良好線性關系。在此條件下以S/N≥3計，異蓮心堿在血漿中的最低檢測濃度為0.10 μg·mL-1，最低定量濃度為0.50 μg·mL-1。

2.6 精密度試驗

取空白血漿配制異蓮心堿濃度分別為2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的樣品，按照“2.3”項下方法操作。每個質量濃度進行6份樣本分析，連續測定3 d，以異蓮心堿的峰面積用當日的回歸方程求出質量濃度，將結果進行統計分析求算日內、日間精密度。精密度試驗結果見表1。

表1 精密度試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of precision（n＝6）

2.7 提取回收率試驗

取空白血漿配制異蓮心堿質量濃度分別為2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列血漿QC樣本各6份，按“2.3”項下方法操作。記錄異蓮心堿峰面積為A1；另取一定量的異蓮心堿標準品貯備液，配制成質量濃度分別為2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列標準溶液各6份，以同體積進樣，記錄色譜圖。異蓮心堿的峰面積為A2，以（A1/A2）×100%計算提取回收率。提取回收率試驗結果見表2。

2.8 穩定性試驗

2.8.1 長期穩定性試驗 于空白血漿中加入一定量的異蓮心堿標準品貯備液，配制成2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列血漿QC樣本各3份，于－20 ℃分別冷凍0、1、3、5、7、15、30、60 d后，取出待完全溶解后按“2.3”項下方法操作并記錄異蓮心堿峰面積，與0 d相比求得標準血漿樣本的偏差。結果表明，標準血漿QC樣本在－20℃條件下至少可以保持60 d穩定，相對偏差在－5.92%～4.28%內。

表2 提取回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of extraction recovery（n＝6）

2.8.2 反復凍融穩定性試驗 于空白血漿中加入一定量的異蓮心堿標準品貯備液，配制成2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列血漿QC樣本各3份，于－20℃冷凍24 h，取出待完全溶解后按照“2.3”項下方法操作，行HPLC分析并記錄異蓮心堿峰面積。反復凍融3次，與未凍融前相比求得標準血漿樣本的偏差。結果表明，標準血漿QC樣本在3次凍融條件下均保持穩定，相對偏差在－3.86%～5.70%內。

2.8.3 室溫穩定性試驗 于空白血漿中加入一定量的異蓮心堿標準品貯備液，配制成2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列血漿QC樣本各3份，于室溫分別放置0、2、4、6、8、12、24 h后按“2.3”項下方法操作并記錄異蓮心堿峰面積，與0 h相比求得標準血漿樣本的偏差。結果表明，標準血漿QC樣本在室溫放置24 h內可以保持穩定，相對偏差在－2.06%～3.37%內。

2.9 藥動學研究

Wistar大鼠6只，♀♂兼半，體重（220±30）g，分別iv 25 mg·kg-1異蓮心堿（給藥前禁食不禁水12 h），并于給藥后5、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270 min尾靜脈采血0.3 mL，肝素抗凝，12000 r·min-1離心5 min，取上清血漿100 μL，按“2.3”項下方法操作并記錄異蓮心堿峰面積。所得血藥濃度-時間曲線數據采用中國藥理學會數學專業委員會編制的DAS 2.0藥動學軟件計算參數。異蓮心堿平均濃度-時間曲線見圖2；異蓮心堿在大鼠體內的主要藥動學參數見表3。

圖2 異蓮心堿平均濃度-時間曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of isoliensine

3 討論

異蓮心堿靜脈給藥后在大鼠體內呈二室開放模型。t1/2β＞t1/2α，提示藥物在大鼠體內以消除為主；Vd為（0.647±0.091）L·kg-1，遠遠大于大鼠體液體積，說明異蓮心堿在大鼠組織內亦有廣泛分布。

異蓮心堿在血漿中的穩定性較好，室溫放置、反復凍融、長期凍融均穩定。但是長期放置血漿樣品容易滋生微生物而污染色譜柱，因此血漿樣品最好采取－20℃冷凍保存且盡可能快速測定。

表3 異蓮心堿在大鼠體內的主要藥動學參數（±s，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetics parameters of isoliensine in rats（±s，n＝6）

表3 異蓮心堿在大鼠體內的主要藥動學參數（±s，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetics parameters of isoliensine in rats（±s，n＝6）

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筆者對甲醇-水、甲醇-0.6%三乙胺、甲醇-0.1%四氫呋喃、乙腈-水、乙腈-0.1%四氫呋喃等流動相體系進行了考察。結果發現，甲醇-乙腈-0.05mol·L-1KH2PO4（22∶38∶40）對異蓮心堿的分離效果好，峰形尖銳，因此選用甲醇-乙腈-0.05mol·L-1KH2PO4為流動相體系。

[1]張 帆，王嘉陵，錢家慶.異蓮心堿抗實驗性心律失常作用及對豚鼠心肌動作電位的影響[J].中草藥，2000，31（10）：753.

[2]馮秀玲，喻 欣，肖軍花，等.異蓮心堿對心血管功能及壓力超負荷型左心室肥大的作用[J].華中科技大學學報（醫學版），2002，31（6）：608.

[3]張先洲，蔡鴻生，周延安，等.高效液相色譜法測定蓮子心中3種生物堿的含量[J].藥物分析雜志，1997，12（2）：110.