白及多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的作用研究

柯昌毅，趙春景（1.重慶市第三人民醫(yī)院，重慶市 400014；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶市 400010）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液血便等癥狀[1]。近年來(lái)，我國(guó)UC發(fā)病呈持續(xù)升高趨勢(shì)。UC臨床治療以激素、水楊酸制劑和免疫抑制劑等為主，但療效不夠滿意，且長(zhǎng)期應(yīng)用有較多的不良反應(yīng)。

白及為蘭科植物白及（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）的塊莖，味苦、甘、澀，性微寒，具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌之功效，臨床上用于治療咳血、吐血、潰瘍病出血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂以及燒傷、燙傷等。白及多糖（Bletilla striata polysaccharides，BSPS）是從白及藥材中經(jīng)一定工藝提取所得的多糖，由葡萄糖和甘露糖（1∶4）以β-糖苷鍵聚合而成，平均分子量為65000～150000 kDa，具有抗炎、促凝血、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等生物學(xué)活性[2]。臨床研究提示，白及灌腸液可有效緩解UC臨床癥狀[3]，但其作用機(jī)制目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用惡唑酮（Oxazolone，OXZ）誘導(dǎo)復(fù)制小鼠UC模型，初步探討白及多糖對(duì)UC的作用及其機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

3K30型超低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；550型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioRad公司）。

1.2 試藥

白及（重慶中藥飲片廠，批號(hào)：55100003）由筆者鑒定為真品；BSPS為筆者自制（由白芨塊莖水提醇沉并精制所得，未分級(jí)）；OXZ（美國(guó)Sigma公司）；柳氮磺胺吡啶（SASP，山西同達(dá)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100802）；白細(xì)胞介素（IL）-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α、核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒均購(gòu)自天津康爾克生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

Ⅰ級(jí)純種NIH小鼠，♂，體重24～28 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 復(fù)制UC模型

參考Heller F等[4]方法進(jìn)行。將小鼠暴露腹部皮膚涂抹3%OXZ（100%乙醇溶劑）0.2 mL，第2天重復(fù)1次，5 d后經(jīng)肛門(mén)緩慢注入0.8%OXZ（50%乙醇溶劑）0.15 mL；對(duì)照小鼠僅于腹部涂抹生理鹽水，5 d后以生理鹽水0.15 mL灌腸。

2.2 分組和給藥

小鼠隨機(jī)分為對(duì)照（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、SASP（370 mg·kg-1）和BSPS高、中、低劑量（320、160、80 mg·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)10 d。末次給藥24 h后處死小鼠，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

2.3 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分

分別于灌腸后3 d和末次灌胃后，按Okayasu I等[5]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI評(píng)分。

2.4 結(jié)腸損傷評(píng)分

分離距肛門(mén)2 cm以上結(jié)腸6～8 cm，稱重后沿腸系膜縱軸剪開(kāi)，以生理鹽水沖洗，并將腸黏膜向上平鋪于蠟板上，參照Luk HH等[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸組織大體評(píng)分；制作HE染色病理切片，參照Ekstrom GM等[7]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸組織病理評(píng)分。

2.5 結(jié)腸指數(shù)測(cè)定

根據(jù)公式計(jì)算結(jié)腸指數(shù)：結(jié)腸指數(shù)＝結(jié)腸重量/體重×100%。

2.6 ELISA法檢測(cè)IL-10、TNF-α、NF-κB水平

制備10%結(jié)腸組織勻漿，4℃下，4000 r·min-1離心20 min，保留上清液，備用。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定IL-10、TNF-α、NF-κB水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 BSPS對(duì)模型小鼠DAI的影響

灌腸3 d后，模型組和BSPS組小鼠出現(xiàn)體重下降、腹瀉和肉眼血便，其DAI顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；ig給藥10 d后，SASP和BSPS高、中劑量組DAI較模型組顯著減低（P＜0.01或P＜0.05）。白及多糖對(duì)模型小鼠DAI的影響見(jiàn)表1。

表1 白及多糖對(duì)模型小鼠DAI的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effect of B.striata polysaccharides on DAI in model mice（±s，n ＝5）

表1 白及多糖對(duì)模型小鼠DAI的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effect of B.striata polysaccharides on DAI in model mice（±s，n ＝5）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別對(duì)照組模型組SASP組BSPS低劑量組BSPS中劑量組BSPS高劑量組3 d 0±03.02±0.28＊3.11±0.222.94±0.183.07±0.243.13±0.2110 d 0±03.15±0.23＊2.64±0.19#2.87±0.172.69±0.11#2.44±0.16##

3.2 BSPS對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織大體和病理評(píng)分的影響

模型組結(jié)腸黏膜可見(jiàn)明顯充血、水腫、糜爛和潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓形；病理學(xué)檢查可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)腸黏膜腺體破壞、隱窩消失、上皮細(xì)胞脫落形成淺潰瘍，結(jié)腸組織大體評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；SASP和BSPS高、中劑量組潰瘍數(shù)量顯著減少，充血水腫顯著減輕，伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)腸組織大體評(píng)分和病理組織學(xué)評(píng)分較模型組顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。白及多糖對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織大體和病理評(píng)分的影響見(jiàn)表2。

表2 白及多糖對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織大體和病理評(píng)分的影響（±s，n＝5）Tab 2 Effect of B.striata polysaccharides on tissular general score and histological score in model mice（±s，n＝5）

表2 白及多糖對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織大體和病理評(píng)分的影響（±s，n＝5）Tab 2 Effect of B.striata polysaccharides on tissular general score and histological score in model mice（±s，n＝5）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別對(duì)照組模型組SASP組BSPS低劑量組BSPS中劑量組BSPS高劑量組病理評(píng)分1.21±0.4411.53±1.62＊9.21±0.78#10.67±1.858.93±0.69#6.46±0.45##大體評(píng)分0±07.73±0.71＊5.48±0.46#6.69±0.875.17±0.42#4.37±0.58##

3.3 BSPS對(duì)模型小鼠結(jié)腸指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，模型組結(jié)腸指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，SASP和BSPS高、中劑量組結(jié)腸指數(shù)顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。白及多糖對(duì)模型小鼠結(jié)腸指數(shù)的影響見(jiàn)表3。

3.4 BSPS對(duì)模型小鼠結(jié)腸IL-10、TNF-α和NF-κB水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組IL-10顯著降低，TNF-α和NF-κB均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SASP和BSPS高、中劑量組IL-10顯著升高，TNF-α和NF-κB顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。白及多糖對(duì)模型小鼠IL-10、TNF-α和NF-κB水平的影響見(jiàn)表4。

表3 白及多糖對(duì)模型小鼠結(jié)腸指數(shù)的影響（±s，n＝5）Tab 3 Effect of B.striata polysaccharides on colon indices in model mice（±s，n＝5）

表3 白及多糖對(duì)模型小鼠結(jié)腸指數(shù)的影響（±s，n＝5）Tab 3 Effect of B.striata polysaccharides on colon indices in model mice（±s，n＝5）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

分組對(duì)照組模型組SASP組BSPS低劑量組BSPS中劑量組BSPS高劑量組1.92±0.203.30±0.43＊2.83±0.31#3.17±0.332.74±0.37#2.36±0.28##結(jié)腸指數(shù)

表4 白及多糖對(duì)模型小鼠IL-10、TNF-α和NF-κB水平的影響（±s，n＝5）Tab 4 Effect of B.striata polysaccharides on IL-10，TNF-α and NF-κB in model mice（±s，n＝5）

表4 白及多糖對(duì)模型小鼠IL-10、TNF-α和NF-κB水平的影響（±s，n＝5）Tab 4 Effect of B.striata polysaccharides on IL-10，TNF-α and NF-κB in model mice（±s，n＝5）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

NF-κB/ng·L-1 277.05±56.391106.47±185.26＊787.22±121.81#1072.01±179.49722.11±110.90#667.79±101.81##分組對(duì)照組模型組SASP組BSPS低劑量組BSPS中劑量組BSPS高劑量組IL-10/pg·mL-1 201.32±27.03108.17±16.21＊102.09±21.18#122.51±16.11157.44±20.75#176.29±24.61#TNF-α/ng·L-1 97.65±16.75332.04±36.90＊179.25±30.71#309.57±33.85167.23±28.66#138.48±23.73##

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎病變主要位于結(jié)腸黏膜和黏膜下層，多累及直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸[8]，腸道持續(xù)炎癥損傷是UC的重要病理改變，并以大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)腸壁和持續(xù)活化為特征。研究認(rèn)為，在遺傳、環(huán)境和病原微生物等因素綜合作用下，機(jī)體免疫系統(tǒng)激活，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡破壞，導(dǎo)致炎性細(xì)胞活化，多種炎癥因子異常釋放是UC發(fā)病的主要機(jī)制。

TNF-α是由單核巨噬細(xì)產(chǎn)生，對(duì)免疫炎癥反應(yīng)均有重要調(diào)節(jié)作用的炎癥介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)UC的發(fā)生[9]。IL-10是具有抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞激活，抑制IL-6、IL-8和TNF-a等促炎癥因子的釋放，在調(diào)節(jié)腸道免疫平衡中起著重要調(diào)節(jié)作用的抗炎因子，對(duì)UC具有保護(hù)作用[10]。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種重要免疫因子的表達(dá)，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用。NF-κB可通過(guò)上調(diào)IL-6，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的異型增生和免疫細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放[11]。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠在出現(xiàn)明顯的UC癥狀和病理形態(tài)學(xué)損傷的同時(shí)，伴有促炎介質(zhì)TNF-α和NF-κB顯著升高，抗炎介質(zhì)IL-10顯著降低，提示炎癥因子平衡失調(diào)和免疫異常是UC重要的病理生理基礎(chǔ)，與既往報(bào)道一致。

本研究中，BSPS可有效降低DAI、結(jié)腸損傷評(píng)分和結(jié)腸指數(shù)，緩解UC病理?yè)p傷和癥狀，抑制TNF-α和NF-κB異常升高，其活性與SASP相似，且具有劑量依賴性。與SASP比較，BSPS還能劑量依賴性上調(diào)IL-10水平，提示BSPS對(duì)炎癥平衡的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于SASP。此外，據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道，長(zhǎng)期大量使用SASP可出現(xiàn)溶血性貧血、紅斑狼瘡綜合征、男性不孕等多種嚴(yán)重不良反應(yīng)，而B(niǎo)SPS為白芨提取制備的純天然高分子化合物，具有自身降解性、無(wú)刺激、無(wú)毒副作用等特點(diǎn)。因此，BSPS具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用較SASP更強(qiáng)、更全面，毒副作用更低的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，BSPS具有促進(jìn)UC腸黏膜修復(fù)、抑制機(jī)體炎癥和恢復(fù)免疫平衡的作用，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α和NF-κB，上調(diào)IL-10水平有關(guān)。

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