石榴皮鞣質(zhì)的急性毒性研究

邱紅梅，賴舒，尚京川，周岐新#（.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室/重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶市 40006；.重慶醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，重慶市 40006）

石榴皮為石榴科植物石榴的干燥果皮。實驗證明，石榴皮提取物有明顯的對抗實驗性胃損傷作用，且其胃黏膜保護作用可能與石榴皮提取物中的主要成分單寧有關(guān)。藥理研究證明，從桃金娘科植物蒲桃皮水浸液中提取的含量為13.4%的單寧對鹽酸-乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護作用[1]；石榴皮鞣質(zhì)（單寧含量約73%）對實驗性胃損傷也有明顯的保護作用[2]。但也有文獻報道單寧能導(dǎo)致人肝壞死[3]；實驗研究也證實其可引起小鼠肝臟毒性[4]。因此，在開發(fā)石榴皮提取物的潛在應(yīng)用時，需要評估其安全性。為此，筆者對石榴皮提取物石榴皮鞣質(zhì)進行了初步的急性毒性實驗研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SZ297型自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；保溫干燥箱（重慶實驗設(shè)備廠）；A2000S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；721型分光光度計（上海第三分析儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

干燥石榴皮（徐州醫(yī)藥有限公司中藥飲片廠，批號：070911，參照丙酮提取、醋酸乙酯萃取法從石榴皮中提取鞣質(zhì)，由重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室尚京川教授提供，其總單寧含量為73%）。實驗所用試劑均為分析純。

1.3 動物

健康昆明種小鼠，♀♂兼半，體重20～25 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供（動物合格證號：SCXK（渝）200220001）。

2 方法

2.1 石榴皮鞣質(zhì)混懸液的制備

精密稱取石榴皮鞣質(zhì)10.27 g，置于研缽中，10 mL0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液分多次加入，每次加入后盡量研磨石榴皮鞣質(zhì)至細膩，即得濃度為102.7%的石榴皮鞣質(zhì)混懸液。避光保存，備用。用前搖勻，并將其作為預(yù)實驗中的最大給藥濃度。

2.2 石榴皮鞣質(zhì)引起小鼠死亡的最小致死量（Dmin）和最大致死量（Dmax）的確定

單寧的半數(shù)致死量（LD50）為6000 mg·kg-1，石榴皮經(jīng)丙酮提取得到的石榴皮鞣質(zhì)含單寧73%，故選用9只小鼠（♀♂兼半），分為2739、8219、24657 mg·kg-1劑量給藥，給藥容積為0.2 mL·10 g-1，觀察小鼠在給藥后7 d內(nèi)死亡情況，得到Dmin＝8219 mg·kg-1。在Dmin的基礎(chǔ)上遞減劑量，得到D0%＝4609.81 mg·kg-1，再在Dmin的基礎(chǔ)上給藥，連續(xù)劑量增加的系數(shù)是1.15，直到小鼠全部死亡得到Dmax，即D100%＝15963 mg·kg-1。

2.3 分組和給藥

根據(jù)公式：1/K＝（N－1）×（Dmax－Dmin）/2進行分組（式中：1/K為組間比值；N為分組數(shù)）。在D100%和D0%之間取7組。將D100%和D0%的值換算成對數(shù)，再按等對數(shù)距離分組。70只小鼠隨機均分為 A、B、C、D、E、F、G 7個組，劑量分別為 15963.00、12978.00、10551.12、8578.25、6974.19、5670.07、4609.81 mg·kg-1。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 觀察小鼠的不良反應(yīng)和死亡情況 給藥當(dāng)天密切觀察給藥后小鼠的反應(yīng)情況，然后每天上午8時、下午2時各觀察1次，持續(xù)觀察7 d小鼠的不良反應(yīng)和死亡情況，記錄各組小鼠死亡情況。

2.4.2 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 各組存活小鼠，給藥24 h后斷頭處死，分離肝臟組織，固定切片，HE染色鏡檢。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 石榴皮鞣質(zhì)對小鼠體重的影響

分別于給藥前（即0 d）和給藥后第3天、第7天稱重，發(fā)現(xiàn)各組存活小鼠體重?zé)o顯著性差異，體重在給藥停止后逐漸增加。石榴皮鞣質(zhì)對小鼠體重的影響見表1。

表1 石榴皮鞣質(zhì)對小鼠體重的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effect of P.granatum tannins on body weight of mice（±s，n＝10）

表1 石榴皮鞣質(zhì)對小鼠體重的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effect of P.granatum tannins on body weight of mice（±s，n＝10）

組別A組B組C組D組E組F組G組劑量/mg·kg-1 4609.815670.076974.198578.2510551.1212978.2615963.00體重/g 0 d 20.59±2.2021.94±2.6020.86±1.5220.75±2.3121.36±1.8620.67±1.9020.46±1.233 d 24.54±1.7625.36±1.5523.12±1.2324.33±1.4324.54±1.7622.96±3.1021.87±2.057 d 26.60±2.0827.36±1.0925.65±2.1626.75±2.3126.24±1.4425.30±2.0323.66±1.94

3.2 石榴皮鞣質(zhì)對小鼠死亡率的影響和LD50計算

各組小鼠死亡多發(fā)生在給藥后1～3 d內(nèi)，小鼠死亡率呈劑量依賴性增高，具體表現(xiàn)為對刺激反應(yīng)減弱或消失，呼吸困難，心跳減弱直至死亡。對死亡小鼠立即解剖，可見肝臟出現(xiàn)白色點狀壞死，其它器官均正常。各組存活小鼠亦見類似癥狀，但較輕，當(dāng)日或次日即可進食。小鼠ig給予石榴皮鞣質(zhì)的LD50＝8469.28 mg·kg-1；LD50的95%可信限＝（8469.28±1216.58）mg·kg-1（范圍：7252.70～9685.83 mg·kg-1）。石榴皮鞣質(zhì)對小鼠死亡率的影響見表2。

表2 石榴皮鞣質(zhì)對小鼠死亡率的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effect of P.granatum tannins on mortality of mice（±s，n＝10）

表2 石榴皮鞣質(zhì)對小鼠死亡率的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effect of P.granatum tannins on mortality of mice（±s，n＝10）

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3.3 石榴皮鞣質(zhì)對小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

病理切片顯示，隨劑量的增加，肝臟組織依次出現(xiàn)氣球樣改變、胞漿疏松化，點狀壞死以及大片狀壞死。石榴皮鞣質(zhì)對小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響見圖1。

圖1 石榴皮鞣質(zhì)對小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響A.A組；B.B組；C.C組；D.D組；E.E組；F.F組；G.G組Fig 1 Effect of P.granatum tannins on pathomorphology of liver tissue in miceA.A group；B.Bgroup；C.C group；D.D group；E.E.E mg·kg-1 group；F.F group；G.G group

4 討論

石榴皮性溫，味甘、酸、澀，具有澀腸、止血、收斂止瀉和殺蟲功效。石榴皮主要成分為單寧，其含量約為10.4%～21.3%；其他成分包括蠟0.8%、樹脂4.5%、甘露醇1.8%、糖2.7%、樹膠3.2%、菊粉1.0%、黏質(zhì)0.6%、沒食子酸4.0%等[5]。但也有文獻[7]報道，單寧長期大量應(yīng)用可引起肝小葉中央壞死、脂肪肝、肝硬化，過量服用可引起血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶異常增高和嚴重肝損壞，導(dǎo)致人體肝壞死[8]。單寧還能與皮下蛋白質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生沉淀，甚至能滲透過肝表皮細胞而產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致肝損壞[9]。

石榴皮所含的單寧主要是水解單寧，其毒性主要表現(xiàn)為直接肝臟毒性。本研究結(jié)果顯示，含單寧73%的石榴皮提取物在給藥劑量為15963.00 mg·kg-1時，其致死率為100%，根據(jù)改良寇氏法[5，6]求得石榴皮鞣質(zhì)的LD50＝8469.28mg·kg-1，LD50的 95%可信限＝（8469.28±1216.58）mg·kg-1（范圍：7252.70～9685.83 mg·kg-1）。出現(xiàn)死亡的小鼠表現(xiàn)為對刺激反應(yīng)減弱或消失，呼吸困難，心跳減弱，直至死亡，經(jīng)過尸檢發(fā)現(xiàn)有不同程度的肝臟壞死。肝臟病理學(xué)研究顯示，隨石榴皮鞣質(zhì)劑量的增加，肝臟組織出現(xiàn)劑量依賴性肝損傷和壞死，但其它器官良好，各組存活的小鼠體重?zé)o顯著性差異，體重在停藥后穩(wěn)步增長。研究表明，石榴皮鞣質(zhì)應(yīng)避免大劑量一次性服用，以免造成肝損傷并導(dǎo)致死亡。石榴皮提取物長期小劑量使用的安全性如何，尚需進一步研究。

[1]Ramirez RO，Roa CC Ir.The gastroprotective effect of tannins extracted from duhat（Syzygium cumini Skeels）bark on Hcl/ethanol induced gastric mucosal injury in spraguedawley rats[J].Clin Hemorheol Microcirc，2003，29（3-4）：253.

[2]賴 舒，周岐新，張 穎，等.石榴皮鞣質(zhì)對實驗性胃損傷的作用[J].中國中藥雜志，2009，34（10）：1290.

[3]王希海，黃光照.藥用植物引起中毒性肝病時的病理變化[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，1996，6（4）：48.

[4]國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會編.中華本草（第5卷）[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：664.

[5]徐淑云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1108.

[6]周緒正，張繼瑜.小鼠和大鼠口服氫溴酸檳榔堿的急性毒性試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2007，28（9）：34.

[7]楊麗平，楊永紅.石榴皮的研究進展[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2004，25（3）：45.

[8]阮志平.植物單寧與健康[J].中國食物與營養(yǎng)，2006，22（8）：48.

[9]Ogasawara H，Todate A.Subchronic oral toxicity study of tannic acid in F344 rats[J].Eisei Shikenjo Hokoku，1990，10（8）：84.