紅花注射液對大鼠周圍神經缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究

彭其勝（重慶市涪陵中心醫院，重慶市 408000）

周圍神經缺血再灌注（IR）損傷在臨床上較常見，多繼發于創傷、血栓形成、斷肢再植、筋膜間隙綜合征、肢體大動脈損傷以及較長時間應用止血帶等造成周圍神經缺血，在恢復血流灌注后不僅不能改善神經功能，反而進一步加重組織損傷[1]。

紅花（Carthamus tinctorius），又叫草紅、刺紅花、杜紅花、金紅花，為菊科植物紅花的管狀花。紅花是一味傳統的活血祛瘀中藥，研究發現，其具有擴張血管、改善微循環、抗炎、清除自由基等功能[2]。紅花注射液為紅花經現代制藥工藝分離提取制備而成，臨床上多用于心腦血管疾病和糖尿病周圍神經炎的治療。動物研究發現，紅花注射液對腸IR損傷具有保護[3]，能否將紅花注射液用于周圍神經IR損傷尚未見報道。本研究擬采用周圍神經IR大鼠模型，初步探討紅花注射液在周圍神經IR損傷中的保護作用及其機制，為臨床防治周圍神經IR損傷提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

3K30型超低溫離心機（德國Sigma公司）；550型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；UV-265紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；Evomatic-8000誘發型電位儀（丹麥Dantec公司）；電感耦合等離子體原子發射光譜儀（美國PE公司）。

1.2 試藥

紅花注射液（雅安三九藥業有限公司，批號：100105，規格：5 mL/支）；20%甘露醇注射液（石家莊四藥有限公司，批號：101105235，規格：50 g∶250 mL）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯免疫法（ELIA）試劑盒購自天津康爾克生物科技有限公司。

1.3 動物

Ⅰ級純種SD大鼠，♂，體重180～200 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 復制周圍神經IR模型

參照文獻[4]復制周圍神經IR模型。SD大鼠以4%水合氯醛ip麻醉，固定，剪開一側腹股溝部皮膚，用10 g捏持力的無損傷動脈夾阻斷髂總動脈起始處，再用2個同樣的動脈夾夾于髂內、髂外動脈的起始處，靜脈血管不予阻斷，6 h后松開動脈夾，恢復血流。對照大鼠僅分離暴露髂總動脈、髂內動脈和髂外動脈6 h。

2.2 分組和給藥

30只大鼠隨機分為對照（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、甘露醇（20%，5 mL·kg-1）和紅花注射液高、中、低劑量（32、16、8 mL·kg-1）組。除對照組外，各組分別于恢復血流灌注同時尾iv相應藥物。再灌注6 h后處死大鼠檢測各項指標。

2.3 肢體功能評估方法

參照Kinnoshitam Y等[5]的量化評估系統評估患肢功能，分值越高功能越差。

2.4 SOD活性檢測

分離坐骨神經，制備10%組織勻漿，4℃下、4000 r·min-1離心20 min，保留上清液，備用。按照SOD試劑盒說明書方法測定SOD活性。

2.5 MDA含量檢測

分離坐骨神經，制備10%組織勻漿，4℃下、4000 r·min-1離心20 min，保留上清液，備用。按照MDA試劑盒說明書測定MDA含量。

2.6 ELISA法檢測TNF-α水平

分離坐骨神經，制備10%組織勻漿，4℃下、4000 r·min-1離心20 min，保留上清液，備用。按照ELISA試劑盒說明書方法測定TNF-α水平。

2.7 神經電生理指標檢測

近端電極置于坐骨神經膝上4 cm，遠端置腓總神經膝下1 cm，接收電板置于脛骨前肌，實驗中電極位置不變。連續動態觀察運動神經傳導速度、動作電位波幅、潛伏期的變化。再灌注5 h后，每15 min記錄1次，取其平均值。

2.8 電感耦合等離子體原子發射光譜法檢測坐骨神經鈣離子水平

將坐骨神經置于1.0 mL濃硝酸，室溫消化1 h后放入65℃烤箱，4 h后加入5 mL去離子水，1500 r·min-1離心5 min。取上清液，于422.7 nm波長處檢測鈣離子水平。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 紅花注射液對模型大鼠肢體功能評分的影響

模型組大鼠肢體功能評分較對照組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，甘露醇和紅花注射液高、中劑量組肢體功能評分顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。紅花注射液對模型大鼠肢體功能評分影響見表1。

表1 紅花注射液對模型大鼠肢體功能評分的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effect of C.tinctorius injection on limb function score of model rats（±s，n＝5）

表1 紅花注射液對模型大鼠肢體功能評分的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effect of C.tinctorius injection on limb function score of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別對照組模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組肢體功能評分0±010.63±1.74＊7.29±1.19#11.07±1.817.54±1.24#5.52±0.90##

3.2 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經SOD和MDA的影響

與對照組比較，模型組SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，甘露醇和紅花注射液高、中劑量組SOD活性顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。紅花注射液對模型大鼠坐骨神經SOD和MDA的影響見表2。

表2 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經SOD和MDA的影響（±s，n＝5）Tab 2 Effect of C.tinctorius injection on SOD and MDA in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表2 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經SOD和MDA的影響（±s，n＝5）Tab 2 Effect of C.tinctorius injection on SOD and MDA in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

MDA/nmol·mg-1 12.66±2.7731.50±3.59＊23.06±2.62#29.22±3.3221.87±3.94#18.61±2.12#組別對照組模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組SOD/U·mg-1 186.41±23.68107.57±15.43＊139.31±20.17#112.48±20.32128.09±23.14#157.24±28.11##

3.3 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經TNF-α的影響

與對照組比較，模型組TNF-α顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，紅花注射液高劑量組TNF-α顯著降低（P＜0.05）。紅花注射液對模型大鼠坐骨神經TNF-α的影響見表3。

3.4 紅花注射液對模型大鼠神經電生理的影響

與對照組比較，模型組神經潛伏期顯著延長，神經傳導速度和波幅顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，甘露醇和紅花注射液高劑量組神經潛伏期顯著縮短，神經傳導速度和波幅顯著增加（P＜0.01或P＜0.05）。紅花注射液對模型大鼠神經電生理的影響見表4。

表3 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經TNF-α的影響（±s，n＝5）Tab 3 Effect of C.tinctorius injection on TNF-α in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表3 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經TNF-α的影響（±s，n＝5）Tab 3 Effect of C.tinctorius injection on TNF-α in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組5.37±1.7210.54±1.41＊9.13±1.099.21±1.248.62±1.125.58±0.95#TNF-α/ng/L-1

表4 紅花注射液對模型大鼠神經電生理的影響（±s，n＝5）Tab 4 Effect of C.tinctorius injection on neural electrophysiology of model rats（±s，n＝5）

表4 紅花注射液對模型大鼠神經電生理的影響（±s，n＝5）Tab 4 Effect of C.tinctorius injection on neural electrophysiology of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

波幅/mV 9.76±1.641.98±0.45＊4.71±0.79#2.32±0.395.31±0.77#6.54±0.88##組別對照組模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組潛伏期/ms 1.37±0.255.15±0.76＊3.81±0.41#4.94±0.624.02±0.532.96±0.37#傳導速度/m·s-1 42.52±6.1322.14±4.29＊30.58±4.51#19.63±3.8327.72±3.7935.03±5.75##

3.5 紅花注射液對模型大鼠神經鈣離子的影響

與對照組比較，模型組坐骨神經鈣離子含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，甘露醇和紅花注射液高劑量組坐骨神經鈣離子含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。紅花注射液對模型大鼠坐骨神經鈣離子的影響見表5。

表5 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經鈣離子的影響（±s，n＝5）Tab 5 Effect of C.tinctorius injection on calcium in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表5 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經鈣離子的影響（±s，n＝5）Tab 5 Effect of C.tinctorius injection on calcium in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

鈣離子/μg·g-1 19.46±3.1681.11±10.92＊54.07±8.28#86.42±12.6361.73±9.3147.81±7.64##分組對照組模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組

4 討論

周圍神經組織由于血供豐富、耗氧量低，且能迅速適應無氧代謝，故較少發生IR損傷。但隨著車禍傷、機械切割傷等易致肢體長時間缺血缺氧損傷發生率的不斷提高，對于周圍神經IR損傷的防治也日益受到重視。

研究認為，周圍神經IR主要損傷不是發生于缺血期間，而是在血液灌注恢復，氧分子重新進入組織后[6]。在正常生理條件下，由于機體有強大的自由基防御系統，可將產生的自由基及時清除。而IR時抗氧化物質在缺血期間已被大量消耗滅活，血流恢復時自由基產生急劇增加，清除能力卻顯著下降，造成自由基的堆積。自由基可直接攻擊神經髓鞘髓磷脂，造成脂質過氧化損傷，導致髓鞘水腫，細胞膜通透性增加[7]。隨著細胞膜通透性升高，鈣離子內流隨之升高，細胞內出現鈣超載，鈣超載可進一步加重細胞內氧化應激失衡，形成氧化應激失衡與鈣超載的惡性循環[8]。MDA水平可反映機體氧自由基水平，SOD則是抗氧化應激系統的重要組成部分，通過檢測MDA和SOD水平可以初步評價機體氧化應激平衡系統。此外，研究認為細胞因子也參與了周圍神經IR的病理生理進程。在周圍神經IR損傷部位發現了炎性細胞、巨噬細胞和淋巴細胞及其相關細胞因子。相關研究也顯示，在周圍神經IR損傷部位，促炎因子TNF-α表達增加[9]。

本實驗結果表明，模型組大鼠肢體功能和神經電生理指標顯著減退，表明IR導致大鼠坐骨神經組織機構和功能受損。MDA、TNF-α和鈣離子水平隨之顯著升高，SOD活性顯著降低，則提示氧化應激平衡失調、鈣超載和炎癥反應參與了周圍神經IR損傷，與文獻報道一致。紅花注射液和甘露醇均能降低坐骨神經組織MDA和鈣離子含量，升高SOD活性，顯著改善大鼠肢體功能評分和神經電生理指標。與甘露醇比較，紅花注射液還能明顯降低TNF-α濃度，表明紅花注射液抗炎作用強于甘露醇。同時實驗數據顯示，紅花注射液的上述作用具有劑量依賴性。

本研究表明，紅花注射液對周圍神經IR損傷具有保護作用，其作用機制可能與抑制氧化應激、抗炎和減少鈣離子內流有關。

[1]鄭 杰，肖魯偉.周圍神經缺血/再灌注損傷及馬尾壓迫癥[J].醫學綜述，2010，16（1）：93.

[2]馮 濤，閻婷婷，閻國榮，等.紅花提取物清除自由基能力的初步研究[J].天津農學院學報，2010，17（1）：6.

[3]高永剛，王宏磊，武繼軍.紅花注射液復合黃芪注射液對大鼠腸缺血再灌注損傷的實驗研究[J].時珍國醫國藥，2010，21（8）：1944.

[4]邵 珩，舒衡生，李云生.周圍神經缺血再灌注損傷動物模型的改良[J].解剖學研究，2009，31（3）：194.

[5]Kinoshita Y，Monafo WW.Nerve and muscle blood flow during hindlimb ischemia and reperfusion in rats[J].J Neurosurg，1994，80（6）：1078.

[6]Rinker B，Fink BF，Barry NG，et al.The effect of cigarette smoking on functional recovery following peripheral nerve ischemia/reperfusion injury[J].Microsurgery，2011，31（1）：59.

[7]Iida H，Nagasaka T，Shindo K，et al.Effect of the free radical scavenger edaravone on peripheral nerve ischemia-reperfusion injury[J].Muscle Nerve，2009，40（4）：582.

[8]Sahna E，Parlakpinar H，Turkoz Y，et al.Protective effects of melatonin on myocardial ischemia/reperfusion induced infarct size and oxidative changes[J].Physiol Res，2005，54（5）：491.

[9]Wang Y，Kawamura N，Schmelzer JD，et al.Decreased peripheral nerve damage after ischemia-reperfusion injury in mice lacking TNF-alpha[J].J Neurol Sci，2008，267（1-2）：107.