正交試驗優選三草方抗肺癌有效組分群Δ

黃洋，賈曉斌，蔣俊，盧映蓉，許巧梅（.江蘇省中醫藥研究院中藥新型給藥系統重點實驗室/國家中醫藥管理局中藥釋藥系統重點研究室，南京市 20028；2.江蘇大學藥學院，鎮江市 220；.鎮江出入境檢驗檢疫局國家食品添加劑及調味品檢測重點實驗室，鎮江市 22008）

中藥復方三草方（Sancaofang，SCF）是江蘇省中醫藥研究院治療非小細胞性肺癌的臨床驗方，由夏枯草、白花蛇舌草、仙鶴草、墨旱蓮、山茱萸等5味藥材組成，具有滋補肝腎、清熱散結、抗癌之功效，可以改善癥狀，提高患者的生存質量，減少復發機會，延長患者的生存期[1]。文獻報道，SCF各味藥材成分復雜，與抗腫瘤有關的化學成分主要為萜類、黃酮類、甾醇類、有機酸類等[2，3]。本課題組前期研究在“三個層次多維結構”[4，5]組分結構理論指導下對SCF抗肺癌物質基礎進行了探索。結果表明，SCF抗肺癌是多種組分（組分群）共同作用的結果，其發揮抗肺癌作用的組分主要包括黃酮、酚酸以及萜類組分。本文報道筆者在前期研究的基礎上，從組分、成分不同層次上合理選擇考察指標，對SCF抗肺癌有效組分群的提取工藝進行研究，為該復方后續的研究以及制劑的開發提供依據。

1 儀器與材料

UV-28型紫外-可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；高效液相色譜儀，包括717自動進樣系統、2996檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）。

夏枯草、白花蛇舌草、仙鶴草、墨旱蓮、山茱萸藥材均購于安徽亳州滕王藥業有限公司，產地分別為安徽、江西、安徽、浙江、安徽，批號均為20080815，經南京中醫藥大學藥學院吳德康教授鑒定為真品；咖啡酸、蘆丁、熊果酸、齊墩果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為885-200001、100080-200707、11074-200516、110709-200304）；迷迭香酸標準品（上海順勃生物工程技術有限公司，批號：080420，含量≥98%）；甲醇、乙腈、醋酸為色譜純，其余試劑均為國產分析純。

RPMI-1640培養粉（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO，廣東光華化學廠有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，南京生興生物有限公司）；滅菌胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；人肺腺癌SPC-A-1細胞株由中國中醫科學院贈送。

2 方法與結果

2.1 總黃酮的含量測定[6]

2.1.1 標準曲線的制備 精密秤取干燥至恒重的蘆丁對照品10.33 mg，置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液。精密量取該對照品溶液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加水至8 mL，加5%硝酸鈉1 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min，加4.3%氫氧化鈉溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，置比色杯中，于510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁檢測濃度（c）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為A＝12.356c+0.0009（r＝0.9994）。

2.1.2 樣品含量測定 精密稱量SCF粉未樣品適量，用適量無水乙醇稀釋成含生藥為100 mg·mL-1的溶液，過濾，棄初濾液，取續濾液為供試品溶液。取該溶液適量，分別置25 mL容量瓶中，各加水至8 mL，加5%硝酸鈉1 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4.3%氫氧化鈉溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，置比色杯中，于510 nm波長處測定吸光度，并計算供試品溶液中總黃酮含量。

2.2 總萜類的含量測定[7]

2.2.1 標準曲線的制備 精密秤取干燥至恒重的熊果酸對照品2.16 mg，置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，即得蘆丁對照品溶液。精密量取該對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分別置于 10 mL 具塞試管中，于100℃水浴揮干，各加5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸0.8 mL，置60℃水浴中加熱10 min，取出置冰水浴中冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，置比色杯中，于548 nm波長處測定吸光度。以熊果酸檢測濃度（c）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為A＝22.417c+0.1301（r＝0.9999）。

2.2.2 樣品含量測定 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。取該溶液適量，置10 mL具塞試管中，于100℃水浴揮干，各加5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，置60℃水浴中加熱10 min，取出置冰水浴中冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，置比色杯中，于548 nm波長處測定吸光度，并計算供試品溶液中總萜類含量。

2.3 咖啡酸、迷迭香酸、蘆丁的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：330 nm；進樣量：20 μL；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸，梯度洗脫（0→20→35 min，甲醇的體積為25%→40%→40%）。

2.3.2 樣品含量測定 精密稱取咖啡酸、迷迭香酸和蘆丁對照品適量，加甲醇制成濃度分別為0.0193、0.1274和0.3700 mg·mL-1的對照品溶液；精密稱取SCF樣品適量，用75%乙醇超聲提取30 min，過濾，取續濾液適量，濃縮至近干，加甲醇稀釋至濃度為生藥量100 mg·mL-1，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。在上述色譜條件下，取供試品溶液進樣測定，根據回歸方程[咖啡酸：Y＝5×106X+895.05（r＝0.9999），線性范圍為0.0060～0.1932 μg；迷迭香酸：Y＝2×106X+3361.3（r＝0.9999），線性范圍為0.0398～1.2740 μg；蘆丁：Y＝8×105X+9929.7（r＝0.9999），線性范圍為0.1156～3.700 μg]計算3種成分的含量。

2.4 齊墩果酸的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL；乙腈-pH7.6磷酸水溶液（55∶45）等度洗脫。

2.4.2 樣品含量測定 精密稱取齊墩果酸對照品適量，加甲醇制成濃度0.1100 mg·mL-1的對照品溶液；精密稱取SCF樣品適量，用75%乙醇超聲提取30 min，過濾，取續濾液適量，濃縮至近干，加甲醇稀釋至濃度為生藥量100 mg·mL-1，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。在上述色譜條件下，取供試品溶液進樣測定，根據回歸方程[Y＝450411X+1095.6（r＝0.9999），線性范圍為0.0344～1.1000 μg]計算齊墩果酸的含量。

2.5 正交試驗優選工藝

2.5.1 正交試驗設計 根據單因素考察結果和文獻報道，影響SCF有效組分群提取工藝的因素主要有乙醇濃度（A）、溶劑用量（B）、提取次數（C）和提取時間（D）。因此，筆者選其為考察因素，采用L9（34）正交試驗表，以SCF一個復方量藥材為研究量，以總黃酮、蘆丁、總萜類、齊墩果酸、咖啡酸和迷迭香酸的含量為指標，優選最佳工藝條件。因素水平見表1；含量測定結果見表2。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 含量測定結果Tab 2 Results of content tests

2.5.2 評分方法的制定 SCF各組分均采用綜合評分法。其中黃酮組分將總黃酮和蘆丁含量總系數設為1，其中總黃酮系數0.7，蘆丁系數0.3，評分公式為得分（Y）＝總黃酮含量/最高組黃酮含量×0.7+蘆丁含量/最高組蘆丁含量×0.3；萜類組分將總萜類和齊墩果酸含量總系數設為1，其中總萜類系數0.7，齊墩果酸系數0.3，評分公式為得分（Y）＝總萜類含量/最高組萜類含量×0.7+齊墩果酸含量/最高組齊墩果酸含量×0.3；酚酸組分將咖啡酸和迷迭香酸含量總系數設為1，其中咖啡酸和迷迭香酸系數均設為0.5，評分公式為得分（Y）＝咖啡酸含量/最高組咖啡酸含量×0.5+迷迭香酸含量/最高組迷迭香酸含量×0.5。

2.5.3 正交試驗結果分析 根據上述評分方法，對各組試驗進行評分，并進行直觀分析和方差分析，以優選出最佳工藝，結果分別見表3、表4。

表3 直觀分析Tab 3 Direct-viewing analysis

由表3、表4可知，各指標下，D因素一致，均為3次；B、C因素對提取結果無顯著性影響。其中，B因素的3個水平提取結果相近，為了節省乙醇用量，選擇8倍量；C因素中水平2、3提取結果相近，并高于水平1，為了節省提取時間，選擇水平2即2 h。但以黃酮、三萜組分為指標，在A因素上不一致，按黃酮組分為指標應選60%乙醇，按萜類組分為指標應選75%乙醇。為了確定最終工藝，以A1B1C2D3、A2B1C2D3工藝為研究對象，結合細胞藥效試驗進行篩選，以半數抑制濃度（IC50）為指標進行藥效評價，確定最終工藝。

表4 方差分析結果Tab 4 Results of variance analysis

2.6 藥效學試驗

2.6.1 試驗方法 通過研究2種工藝提取物對人肺腺癌SPC-A-1細胞增殖活性的影響確定最終工藝[8]。取對數生長期細胞使其脫壁，用10%胎牛血清RPMI1640培養液重懸成單細胞懸液，以每孔4×104個細胞接種于96孔細胞培養板，每孔培養液100 μL。將培養板移入細胞培養箱繼續培養24 h，吸棄孔內原培養液，加入不含胎牛血清RPMI1640培養液90 μL，再加入10 μLSCF提取液不同濃度的PBS溶液，經初步的預試驗，生藥濃度均設置為10.0、5.0、2.5、1.0 、0.5 mg·mL-1的濃度梯度。然后移入細胞培養箱繼續培養36 h，每個藥物濃度設6個平行復孔，設上下本底對照孔，另設順鉑（終濃度為25 mg·L-1）陽性對照組和PBS空白對照組。到時間吸棄孔內原培養液，加入不含胎牛血清RPMI1640培養液100 μL，然后每孔再加入5 mg·mL-1MTT 溶 液10 μL，繼續培養4 h后終止培養，小心吸棄孔內上清液，每孔加DMSO 100 μL，在微量振蕩儀中振蕩10 min，使結晶充分溶解，用酶標儀測定吸光度（A）值，檢測波長為550 nm，參比波長為690 nm。IC50值用SPSS10.0軟件進行計算。試驗重復6次。按下式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率（%）＝（1－組平均A值/空白對照組平均A值）×100%。不同提取物對SPC-A-1細胞增殖作用的影響見圖1；不同提取物對SPC-A-1細胞的IC50見圖2。

2.6.3 試驗結果 由 圖1、圖2可知，在一定濃度范圍內，75%乙醇提取物比60%乙醇提取物對SPC-A-1細胞增殖作用強。與60%乙醇提取物對SPC-A-1細胞的IC50相比，75%乙醇提取物對SPC-A-1細胞的IC50有所下降，并有顯著性差異。因此，結合藥效實驗確定最終工藝為A2B1C2D3，即8倍量75%乙醇，提取3次，每次2 h。

2.7 工藝驗證試驗

圖1 不同提取物對SPC-A-1細胞增殖作用的影響（n＝6）Fig1 Effect of different extracts on the proliferation of SPC-A-1 cells（n＝6）

圖2 不同提取物對SPC-A-1細胞的IC（50±s，n＝6）Fig 2 IC50of different extracts on SPC-A-1 cells（±s，n＝6）

取SCF藥材3份，按上述確定的最佳工藝進行提取，合并提取液，濃縮至合適濃度，并按上述方法測定相關成分的含量。結果，總黃酮、蘆丁、總萜類、齊墩果酸、咖啡酸、迷迭香酸的含量分別為32.817、1.066、25.853、0.324、0.037、0.536 mg·g-1，均較高，表明工藝重現性良好、可行。

3 討論

SCF抗肺癌的物質基礎是由黃酮組分、萜類組分以及酚酸組分共同組成的，因此筆者選擇有效組分群作為研究對象進行提取工藝的研究是科學的、合理的。

本研究在乙醇濃度這一因素無法確定的情況下創新性地結合細胞藥效模型進行了最終的工藝優選，篩選出SCF有效組分群的提取工藝為：藥材8倍量75%乙醇，提取3次，每次2 h，并證明提取工藝重現性好，為該復方的進一步研究打下了基礎。

[1]邵振中，賈曉斌，陳 彥，等.三草方不同極性部位及其配伍后對人肺腺癌SPC-A-1細胞的影響研究[J].中國藥房，2010，21（7）：581.

[2]封 亮，賈曉斌，陳 彥，等.夏枯草化學成分及抗腫瘤機制研究進展[J].中華中醫藥雜志，2008，23（5）：428.

[3]施 峰，賈曉斌，賈東升.白花蛇舌草預防肺癌物質基礎研究思路與方法[J].中華中醫藥雜志，2010，25（3）：403.

[4]賈曉斌，陳 彥，李 霞，等.中藥復方物質基礎研究新思路和方法[J].中華中醫藥雜志，2008，23（5）：420.

[5]施 峰，賈曉斌，陳 彥，等.中醫方藥物質基礎名詞術語標準化探討[J].中國中藥雜志，2009，34（9）：1179.

[6]邵振中，賈曉斌，陳 彥，等.三草方不同極性部位及其配伍后對人肺腺癌SPC-A-1細胞的影響研究[J].中國藥房，2010，21（7）：581.

[7]皮文霞，蔡寶昌，郭勝偉，等.分光光度法測定山茱英制劑中總三萜酸的含量[J].南京中醫藥大學學報，2003，19（2）：99.