正交試驗優選柴胡微波炮制工藝

高妮，龔又明（1.廣州市醫藥職業學校，廣州市 510430；.廣東省中醫院，廣州市 51010）

柴胡是一味常用中藥，具有和解表里、疏肝、升陽等功效。用于感冒發熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經不調、子宮脫垂、脫肛等證的治療[1]。現代藥理研究表明，柴胡具有解熱、抗病毒、抗細菌內毒素、抗炎、降血脂、促酶分泌、保肝、提高免疫力、抗腫瘤、抗驚厥等作用[2～4]。常見的柴胡入藥炮制品有：生柴胡、醋柴胡和酒柴胡。2010年版《中國藥典》只收載了醋柴胡，但柴胡不同炮制品在臨床上具有不同的功效：生柴胡升散作用力強，用于解表退熱；醋炒后獨入肝經血分，增強其疏肝和血、止痛之功，用于郁熱或瘀熱[5]。前期試驗表明，柴胡經醋炙后，柴胡皂苷a、d均有不同程度的降低，而柴胡皂苷b2則大大增加，可能是疏肝的主要成分。目前，對柴胡的炮制工藝主要為酒炙和醋炙2種。本研究首次采用微波炮制法優化醋制柴胡的炮制工藝，并與傳統的醋炙法進行比較，力求尋找出醋制柴胡的新方法。

1 儀器與試藥

Agilent-1100高效液相色譜儀，包括DAD檢測器、自動進樣器、在線脫氣、四元泵（美國安捷倫科技有限公司）；WD800B型格蘭仕微波爐（廣東格蘭仕集團有限公司）；UV-2401PC紫外分光光度計（日本島津公司）；KQ-300VDB型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

柴胡皂苷a、b2標準品（南京蘇朗醫藥科技開發有限公司，純度＞98%，批號分別為20090411、20090624）；柴胡藥材采購于廣州清平中藥材市場，經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定為正品北柴胡；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇、氨水、磷酸、二甲氨基苯甲醛均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 傳統的炮制方法

醋炙法：取柴胡藥材20 g，加入米醋，悶潤約2 h，待輔料被吸盡后放入炒鍋內，文火加熱，炒干，取出放涼，備用（每100 kg藥材加20 kg米醋）。

2.2 微波炮制法

選擇對柴胡質量可能產生影響的4個因素：醋用量（A）、微波熱力（B）、加熱時間（C）、藥材鋪疊厚度（D）作為微波炮制的考察因素。每個因素選擇3個水平（見表1）。試驗取柴胡藥材20 g，加入適量米醋，悶潤約2 h，待輔料被吸盡后根據L9（34）正交試驗表安排進行試驗。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

2.3 柴胡皂苷b2的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Dikma kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（B）-水（A），梯度洗脫（0～15 min，30%→35%B；15～30 min，35%B；30～70 min，35%→40%B）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；進樣量：10 μL。色譜見圖1。

2.3.2 標準品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷b2標準品4.02 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.402 mg·mL-1的柴胡皂苷b2標準品溶液。

圖1 高效液相色譜圖A.柴胡皂苷b2標準品；B.柴胡微波炮制品Fig 1 HPLC chromatogramsA.saikosaponin standard substance；B.microwave processed Bupleuri Radix

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取柴胡生品和炮制品粉末各0.5 g，置于錐形瓶中，加5%氨水-甲醇溶液30 mL，超聲提取1 h，放冷，過濾，濾渣用5 mL的5%氨水-甲醇溶液洗滌3次，過濾，合并濾液，濾液蒸干，用少量的甲醇溶解，轉移至5 mL容量瓶中，并少量多次的洗滌，用洗滌液稀釋至刻度，即得。

2.3.4 標準曲線的制備 分別精密吸取柴胡皂苷b2標準品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.3.1”項下色譜條件測定柴胡皂苷b2的峰面積。以柴胡皂苷b2進樣量（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝372.29X－81.217（r＝0.9998）。結果表明，柴胡皂苷b2進樣量在0.402～8.04 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取柴胡皂苷b2標準品溶液10 μL，按上述色譜條件重復進樣5次，測定峰面積積分值。結果，柴胡皂苷b2峰面積積分值的RSD＝1.02%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取同一批柴胡藥材，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件于0、12、24、36、48 h進樣測定。結果，柴胡皂苷b2峰面積積分值的RSD＝1.89%（n＝5），表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.3.7 重復性試驗 取同一批柴胡藥材樣品5份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件分別進樣10 μL。結果，柴胡皂苷b2峰面積積分值的RSD＝2.37%（n＝5），表明方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取柴胡炮制品粉末0.5 g，精密稱定，加入適量柴胡皂苷b2的標準品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定，計算加樣回收率。結果，柴胡皂苷b2的平均回收率為98.8%，RSD＝2.14%（n＝5）。

2.4 總皂苷的含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 精密稱取生柴胡或柴胡炮制品粉末0.4 g，精密加入濃度為5%的氨性甲醇50 mL，稱定其重量，浸泡30 min后超聲1 h，放冷至室溫，稱重，用5%的氨性甲醇液補足失重，過濾，取續濾液25 mL，70℃水浴濃縮，用甲醇溶解并定容至5 mL。

2.4.2 標準品溶液的制備 精密吸取柴胡皂苷a標準品6.12 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.612 mg·mL-1的標準品溶液。

2.4.3 標準曲線的制備 分別精密量取柴胡皂苷a標準品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，加濃度0.1%對二甲氨基苯甲醛-乙醇溶液0.5 mL，于70℃水溫放置10 min，取出放置至室溫，再加磷酸4 mL，于70℃水溫放置5 min，取出放置至室溫，加入甲醇至刻度。以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法在535 nm波長處測定吸光度，以柴胡皂苷a濃度（c）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A＝0.0103c+0.0395（r＝0.9998）。結果表明，柴胡皂苷a檢測濃度在61.2×10-3～6.12×10-2μg·mL-1范圍內與吸光度呈良好線性關系。

2.5 正交試驗結果

按“2.3”、“2.4”項下方法測定柴胡皂苷b2、總皂苷含量，以此為評價指標，進行方差分析，優選最佳炮制工藝。正交試驗結果見表2；方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結果Tab 3 Result of analysis of variance

由表2、表3可知，以柴胡皂苷b2含量為考察指標，影響微波炮制柴胡的程度依次為C（加熱時間）＞B（微波熱力）＞D（藥材鋪疊厚度）＞A（醋用量），B、C因素對炮制工藝有顯著性影響（P＜0.05），最佳的炮制工藝為A3B3C3D2；以總皂苷含量為指標，影響微波炮制柴胡的程度依次為C＞B＞D＞A，各因素對柴胡炮制工藝均無顯著性影響，其最佳工藝為A2B1C1D2。如果因素B、D水平設計太大，藥材容易糊化或燒焦，且對總皂苷含量也有一定的影響，試驗表明以B2D1為佳；同時考慮到因素A對2個指標均無顯著性影響，從節約的角度考慮，以A1為佳。綜上所述，最佳的微波炮制工藝為A1B2C3D1，即醋的用量為每100 kg藥材加20 kg米醋，藥材平鋪厚度約為1 cm，以微波熱力為60%加熱6 min即可。

2.6 驗證試驗

取同一批柴胡樣品，按“2.5”項下最佳的微波炮制工藝和“2.1”項下的炮制方法進行炮制，然后按“2.3”、“2.4”項下方法測定柴胡生品及其炮制品中柴胡皂苷b2、總皂苷的含量。結果，柴胡生品中柴胡皂苷b2的含量為0.0371%，總皂苷為2.76%；微波炮制品中柴胡皂苷b2的含量為0.7218%，總皂苷為2.49%；醋炙柴胡中柴胡皂苷b2的含量為0.6844%，總皂苷為2.44%，表明微波炮制法具有一定的重復性，而微波炮制法和醋炙法得到的柴胡炮制品中柴胡皂苷b2和總皂苷的含量無顯著性差異。

3 討論

傳統炮制法生產過程中炮制火候、溫度、時間等較難掌握。溫度過高則產品易焦糊，過低則產品含水量較高，且費工費時。微波加熱具有穿透力強、內外同時加熱、省工省時、加熱時間短，且炮制品外觀完整，無焦化、糊化現象[6]。本試驗結果表明，微波醋制柴胡，炮制品為黃色，具有醋氣，無焦化或糊化的現象，符合柴胡炮制品的要求。

試驗采用紫外-可見分光光度計在200～400 nm波長范圍內掃描，測得柴胡皂苷b2分別在243、250、260 nm波長處有最大吸收，其中250 nm吸收強度較大，因此選擇250 nm為柴胡皂苷b2最佳的檢測波長。而對總皂苷含量測定最佳波長的選擇，本試驗以柴胡皂苷a作為標準品，在200～600 nm波長范圍內掃描。結果表明，柴胡皂苷a在535 nm波長處有最大吸收，因此選擇535 nm為柴胡總皂苷的檢測波長。

前期預試驗結果表明，柴胡經醋制后，柴胡皂苷a、d含量均有不同程度的降低，而柴胡皂苷b2含量則大大增加，這可能是疏肝的主要成分。而柴胡總皂苷是評價柴胡質量的主要成分之一，因此選擇柴胡皂苷b2和總皂苷含量為評價指標，同時結合飲片的外觀來篩選微波炮制工藝。結果表明，微波炮制法中的柴胡皂苷b2和總皂苷的含量均略高于傳統的醋炙法，并且炮制的飲片外觀也能達到要求。驗證試驗也表明，微波炮制工藝穩定、可行，因此微波炮制法可作為代替傳統醋炙法的新方法。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：263-264.

[2]白宗利，王 巖，賈天柱.柴胡的藥理作用研究進展[A].中華中醫藥學會.四大懷藥與地道藥材研究論壇暨中藥炮制分會論文集[C].2007：287-291.

[3]萬 方，郭景珍，李 忻，等.柴胡皂苷d對肝纖維化大鼠TPA、PAI、MDA及NO 影響的研究[J].中國藥房，2007，18（24）：1947.

[4]龔 枚，黃正橋.柴胡對肝損傷模型小鼠肝細胞Bax、Bcl-2表達的影響研究[J].中國藥房，2005，16（23）：1779.

[5]龔千鋒主編.中藥炮制學[M].北京：中國中醫藥出版社，2007：188.

[6]宋學玲，袁秀英.微波技術在中藥制藥中的應用[J].衛生職業教育，2007，25（8）：139.