抗溶血顆粒的制備及其質量標準研究

熊愛珍（南昌大學第二附屬醫院，南昌市 330006）

抗溶血顆粒是根據醫院使用多年臨床經驗方選用黃芩、茵陳、山藥、制大黃、甘草等制備的抗溶血合劑改變劑型而成，具有清熱祛濕、利膽退黃等功效[1，2]。能有效降低孕婦血清抗A（B）抗體效價，起到預防和治療母嬰ABO血型不合的作用[3]。

本研究在中醫藥理論指導下，運用現代制劑技術的研究思路和方法，根據各藥材有效成分的理化性質，設計了工藝路線，并建立了相應的質量標準，以確保制劑的質量穩定、安全有效。

1 儀器與試藥

2487紫外檢測器、717高效液相色譜（HPLC）儀、600泵（美國Waters公司）；sb3200超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Sartorius-BT25s電子分析天平（德國賽多利斯）；FA-2004分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）。

黃芩、茵陳、山藥、制大黃、甘草飲片均購自江西匯仁集團醫藥科研營銷有限公司，批號分別為0812013、0812004、081008、0812005、0812005；黃芩苷、綠原酸、大黃素、甘草次酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110715-200514、110753-200413、110756-200110、110723-200411）；硅膠G（青島海洋化工有限公司，批號：200675）；甲醇為色譜純，水為重蒸鎦水，其他試劑均為分析純。

2 處方與制備

2.1 處方

黃芩、茵陳、山藥、制大黃、甘草等。

2.2 制備

將黃芩、茵陳、山藥、制大黃、甘草等藥材粉碎成粗粉，加10倍量的60%乙醇，回流提取3次，每次1 h，得提取液[4]，過濾，回收乙醇、濃縮得流浸膏，加水沉淀除去雜質，減壓濃縮得相對密度為1.31的濃縮物，加入3.5倍混合輔料（糊精∶乳糖∶糖粉），混合輔料的比例為2∶4∶1，混合制軟材，然后過10目篩制粒，70～80℃干燥，再過10目篩，整粒過80目篩篩去細粉，即得[5]。

3 質量標準

3.1 性狀

本品為黃棕色至棕褐色的顆粒，味微苦。

3.2 定性鑒別

3.2.1 黃芩的TLC鑒別 取本品10 g，加水30 mL使溶解，用稀鹽酸調pH至2～3，置聚酰胺小柱（30～60目，1 g，內徑1.2～1.5 cm）上，用乙酸乙酯100 mL洗脫，棄去初洗脫液3 mL，收集續洗脫液，取上清液，蒸干，殘渣加無水乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液；另取除黃芩外，其余各藥材按處方量投料制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液；再取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[6]試驗，分別吸取供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。黃芩的TLC見圖1。

3.2.2 茵陳的TLC鑒別 取本品10 g，研細，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取除茵陳外，其余各藥按處方量投料制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液；再取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[6]試驗，分別吸取供試品溶液和陰性對照溶液10 μL，對照品溶液各5 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。茵陳的TLC見圖2。

3.2.3 大黃的TLC鑒別 取 本品15 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，再加鹽酸4 mL，加熱回流提取30 min，立即冷卻，用乙醚振搖提取3次，每次25 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取除大黃外，其余各藥按處方量投料制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液；再取大黃素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[6]試驗，分別吸取供試品溶液和陰性對照溶液各15 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏后日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的顏色斑點；陰性對照無干擾。大黃的TLC見圖3。

3.2.4 甘草的TLC鑒別 取本品10 g，研細，加甲醇30 mL，加熱回流提取1 h，濾過，濾液加3倍量乙醚，放置使沉淀，濾過，殘渣加鹽酸2 mL、三氯甲烷30 mL，加熱提取1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取除甘草外，其余各藥按處方量投料制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液；再取甘草次酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[6]試驗，分別吸取供試品溶液和陰性對照溶液各15 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-石油醚（30～60℃）-乙酸乙脂-冰醋酸（10∶5∶4∶0.6）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的顏色斑點；陰性對照無干擾。甘草的TLC見圖4。

圖1 黃芩的TLC1.陰性對照；2～4.供試品；5.黃芩苷對照品Fig 1 TLC of Scutellaria baicalensis1.negative control；2～4.test samples；5.baicalin control

圖2 茵陳的TLC1～3.供試品；4.陰性對照；5.綠原酸對照品Fig 2 TLC of Herba Artemisiae Scopariae1～3.test samples；4.negative control；5.chlorogenic acid control

圖3 大黃的TLC1.大黃素對照品；2～4.供試品；5.陰性對照Fig 3 TLC of Radix Et Rhizoma Rhei1.emodin control；2～4.test samples；5.negative control

3.3 檢查

本品應為黃棕色或棕褐色顆粒，其他應符合顆粒劑項下有關的各項規定[6]。

3.4 含量測定

3.4.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（50∶45∶0.2）；流速：0.9 mL·min-1；檢測波長：280 nm[7]；柱溫：40 ℃。理論板數按黃芩苷峰計算應不低于3000。黃芩苷與雜質峰分離良好，雜質對測定無干擾，峰形理想。色譜見圖5。

圖4 甘草的TLC1.甘草次酸對照品；2.陰性對照；3～5.供試品Fig 4 TLC of Radix Glycyrrhizae1.glycyrrhetinic control；2.negative control；3～5.test samples

圖5 高效液相色譜圖A.陰性對照；B.黃芩苷對照品；C.供試品Fig 5 HPLC chromatogramsA.negative control；B.baicalin control；C.test sample

3.4.2 溶液的制備 （1）對照品溶液：精密稱取于60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。（2）供試品溶液：取裝量差異項下的本品約2 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。（3）陰性對照溶液：取除黃芩以外的其他藥材制成的陰性樣品2 g，按供試品溶液方法制成陰性對照溶液。

3.4.3 標準曲線的制備 精密稱定黃芩苷對照品11.81 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度；精密量取1、3、5、7、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液各20 μL，在上述色譜條件下測定峰面積。以對照品的量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝2×106X＋26503（r＝0.9998）。結果表明，黃芩苷進樣量在0.236～2.360 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

3.4.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液（59μg·mL-1）20μL，按上述色譜條件連續進樣5次。結果，黃芩苷峰面積積分值的RSD＝0.96%（n＝5），表明儀器精密度良好。

3.4.5 穩定性試驗 取“3.4.2”項下（2）法制成的供試品溶液，再精密吸取對照品溶液20μL，按上述色譜條件每隔2 h進樣1次，測定10 h內的變化。結果，黃芩苷峰面積積分值的RSD＝1.08%（n＝5），表明供試品溶液在10 h內穩定。

3.4.6 重復性試驗 取同一批號樣品6份，按“3.4.2”項下（2）法分別制成供試品溶液，按上述色譜條件試驗。結果，黃芩苷峰面積積分值的RSD＝1.01%（n＝6），表明方法重復性良好。

3.4.7 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的黃芩苷對照品，按供試品溶液的制備方法制成待測溶液，進樣20μL，按上述測定方法試驗，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

3.4.8 樣品含量測定 取3批樣品，按“3.4.2”項下（2）法制備供試品溶液，進樣20μL，按上述色譜條件測定，計算黃芩苷含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination（n＝3）

4 討論

取黃芩苷對照品溶液，用Waters 2487紫外檢測器在200～400 nm波長范圍內進行光譜掃描，測得黃芩苷最大吸收波長為277 nm和315 nm。參照2005年版《中國藥典》黃芩苷測定方法[6]，本試驗選擇檢測波長為280 nm。

輔料的種類是影響顆粒成型的關鍵因素之一。目前，中藥顆粒劑的常用輔料為糖粉、糊精和乳糖，其中乳糖、糖粉可以掩蓋中藥的不良氣味；糊精被水潤濕后，產生較強的黏性使顆粒變得結實、圓整，在不斷滾動中不容易破碎成細小顆粒。同時，糊精、乳糖和糖粉作為賦形劑優于淀粉，后者制得的顆粒易吸濕軟化，而且加水溶解后，因淀粉溶解度差，底部有白色沉淀。鑒于前三者所制顆粒成型性較好，溶解后無沉淀產生且顆粒崩解速度加快，制出的顆粒外觀均勻、美觀，故采用糊精、乳糖和糖粉作為抗溶血顆粒的混合輔料。

清膏量與混合輔料的配比是影響顆粒成型的關鍵因素之一。2005年版《中國藥典》（一部）中要求：輔料量一般不超過清膏量的5倍。通過試驗得知，清膏量與混合輔料（糊精∶乳糖∶糖粉）的配比為1∶2.5時，軟材較軟，制粒時容易堵塞篩網或成長條形；而配比為1∶3以上時，上述現象不太明顯，軟材易通過篩網，所得顆粒也較圓整。

[1]楊雪山，曲長江.茵陳術附湯對陰黃證黃疸動物模型β-葡萄糖醛酸酶含量UDPGT活性的影響[J].遼寧中醫雜志，2007，34（5）：688.

[2]郭志偉，劉琳娜.大黃及其有效成分的藥理研究概況[J].中國藥房，2006，17（22）：1741.

[3]于 飛，韓惠蘭，吳秀芳.梔風湯對ABO血型不合溶血病抗體效價的影響[J].中國醫科大學學報，2003，32（4）：341.

[4]熊淑華，熊愛珍，方 曉，等.正交試驗設計法優選黃芩的提取工藝[J].中國醫藥導報，2009，20（21）：1621.

[5]李 淼，張榮霞，趙銀安，等.帶狀皰疹顆粒的制備及臨床應用[J].中國藥師，2006，9（6）：536.

[6]國家藥典委員會編.中國人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄31、附錄6、211.

[7]林嘉民，陳嫻瑛，花仲卉.宮寧顆粒質量標準研究[J].中國藥房，2006，17（20）：1582.