HPLC法測(cè)定木薯葉中蘆丁的含量Δ

何翠薇，覃潔萍，黃俏妮（廣西中醫(yī)學(xué)院，南寧市 530001）

木薯（Manihot esculenta Crantz）又叫做樹(shù)薯、木番薯，地下部結(jié)薯，屬于大戟科木薯屬植物[1]。木薯是中國(guó)主要的熱帶作物之一，在廣西各地區(qū)都有栽培，人們種植木薯主要是為了獲取其塊根部分，而其同時(shí)產(chǎn)生的大量莖桿和葉等農(nóng)副產(chǎn)品沒(méi)有得到充分利用。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，在秘魯與巴西一帶的亞馬遜叢林中，土著印第安人千百年來(lái)均有食用木薯葉的習(xí)慣，這一帶居民的抗病能力明顯高于其他地區(qū)，且沒(méi)有人患癌癥及糖尿病、高血壓等疾病[2]。可見(jiàn)木薯除其塊根部分外，其他沒(méi)有充分利用的部分有可能含有有效藥用成分。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，木薯葉中有黃酮類化合物存在[3，4]，但至今未見(jiàn)其化學(xué)成分含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定木薯葉提取物中蘆丁的含量，以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用木薯葉提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型HPLC儀，包括四元泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、VWD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，Agilent 1100色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；AE100型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；SB3200T超聲提取器（必能信超聲（上海）有限公司）。

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707，供含量測(cè)定用）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水（過(guò)0.45 μm微孔濾膜后使用）；木薯葉在不同月份采自廣西桂北地區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院劉壽養(yǎng)副教授鑒定為真品，經(jīng)50℃干燥48 h后粉碎，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸（12∶88）；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：354 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。在此色譜條件下，樣品分離良好。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；1.蘆丁Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.sample；1.rutin

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的蘆丁對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 mL含0.6 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取木薯葉粗粉0.3 g，精密稱定，精密加入60%乙醇50 mL，浸泡后超聲45 min，放冷，以60%乙醇補(bǔ)重，濾過(guò)，取續(xù)濾液1 mL，置于微型離心管中，以10000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

取上述蘆丁對(duì)照品貯備液適量，以乙醇稀釋成濃度分別為0.006、0.018、0.030、0.042、0.054、0.060 mg·mL-1的溶液，按上述色譜條件分別精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝22143X+0.3589（r＝0.9999）。結(jié)果表明，蘆丁檢測(cè)濃度在0.006～0.060 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品貯備液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定蘆丁的峰面積。結(jié)果，RSD＝0.5%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，蘆丁的平均含量為9.60 mg·g-1，RSD＝2.0%（n＝6），表明本法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取室溫放置0、1、2、4、6、8 h的供試品溶液適量，按上述色譜條件測(cè)定蘆丁的峰面積。結(jié)果，RSD＝1.9%（n＝6），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品0.15 g，共6份，分別精密加入蘆丁對(duì)照品貯備液1.3 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按樣品測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算含量和平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定

精密稱取3批次共9份木薯葉樣品粉末各0.3 g，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述方法測(cè)定樣品含量。結(jié)果，3批樣品中蘆丁的含量分別為9.71、9.60、8.64 mg·g-1（n＝3），平均含量為9.32 mg·g-1。

3 討論

在本品含量測(cè)定方法中，通過(guò)供試品與對(duì)照品溶液制備方法、測(cè)定條件的研究，經(jīng)系統(tǒng)適用性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與加樣回收率試驗(yàn)等方法學(xué)考察，證明本方法簡(jiǎn)便、可行，精密度、重復(fù)性、分離度均符合規(guī)定，可為木薯葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

本試驗(yàn)測(cè)定的3批次9份木薯葉樣品分別采集于不同時(shí)期，測(cè)得的蘆丁含量有所不同，原因可能是木薯葉分不同月份采摘，生長(zhǎng)的周期不盡相同，而且受光照、溫度、濕度等多種因素影響所致。今后可對(duì)不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)期的木薯葉作進(jìn)一步研究，以對(duì)木薯葉進(jìn)行充分利用。

綜上，本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為木薯葉中蘆丁的含量測(cè)定方法。

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志（第44卷第2分冊(cè)）[M].北京：科學(xué)出版社，1996：172-174.

[2]陶海騰，呂飛杰，臺(tái)建祥，等.木薯葉營(yíng)養(yǎng)保健功效的開(kāi)發(fā)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（6）：78.

[3]陶海騰，陳曉明，呂飛杰，等.大孔吸附樹(shù)脂法純化木薯葉黃酮的初步研究[J].食品工業(yè)科技，2009，8：192.

[4]陶海騰，陳曉明，呂飛杰，等.木薯葉黃酮類化合物提取研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30（12）：12.