HPLC-ELSD法測定腦通顆粒中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的含量及穩定性Δ

陳祖云，石凌云，黃勇，喬希，王愛民，況時詳，王永林#（.貴陽醫學院藥學院，貴陽市 550004；.貴陽中醫學院附屬第二醫院，貴陽市 55000）

腦通顆粒處方源于貴陽中醫學院第二附屬醫院臨床使用的醫院制劑方，主要由黃芪、水蛭、葛根、天麻、西洋參組成，臨床用于治療心脾氣虛、清陽不升、腦絡不利、腦髓失養等，屬現代輕度血管性老年癡呆范疇，治療效果良好。為了更好地控制腦通顆粒的質量，保證其療效，本試驗采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測（HPLC-ELSD）法對該制劑主要組成藥材黃芪中黃芪甲苷[1～3]和西洋參中含量較高的人參皂苷Rb1[4～6]進行含量測定，并以這2種成分的含量為指標考察該制劑的穩定性。該方法簡便、快速、準確，可為該制劑質量標準的制定提供科學依據；應用該方法的測定結果表明，腦通顆粒中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的穩定性良好。

1 儀器與試藥

Prominenece HPLC儀系統，包括2臺LC-20AD泵、DGU-20A3真空脫氣機、SIL-20AHT自動進樣器、CTO-10ASvp柱溫箱、LC-Solution色譜工作站（日本島津公司）；Alltech ELSD 800蒸發光檢測器（美國奧泰科技公司）；WYB-5000型全自動空氣泵（北京怡豐瑞普科技有限公司）；AE240十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）；CQ250A-TS超聲波清洗器（上海躍進醫用光學器械廠）。

黃芪甲苷、人參皂苷Rb1對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110781-200613、110704-200921）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲醇、正丁醇、氨水等試劑均為分析純；腦通顆粒（貴陽醫學院藥物研究開發中心制備，批號：20090910、20100405、20100410、20100417）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與ELSD條件

色譜柱：Elipse-XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫（梯度見表1）；流速：1 mL·min-1；柱溫：40℃。ELSD器的漂移管溫度：40℃；霧化器壓力：0.30 MPa；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Steps of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取黃芪甲苷對照品23.52 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為1號貯備液；精密稱取人參皂苷Rb1對照品23.50 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為2號貯備液。

分別取人參皂苷Rb1和黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，以甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rb10.8 mg和黃芪甲苷0.4 mg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取裝量差異項下的本品，混勻，取適量，研細，取約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲（功率：100 w，頻率：50 kHz）處理20 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中蒸至近干，殘渣加氨試液30 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，合并正丁醇層，用正丁醇飽和的水50 mL振搖提取，分取正丁醇層，置蒸發皿中蒸干，殘渣加甲醇使溶解，移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 分別取缺西洋參、黃芪藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別吸取黃芪甲苷和人參皂苷Rb1混合對照品溶液、供試品溶液、缺黃芪的陰性對照溶液和缺西洋參的陰性對照溶液各適量，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，黃芪甲苷和人參皂苷Rb1與其他組分峰的分離度均＞1.5，缺黃芪的陰性對照不干擾西洋參中人參皂苷Rb1的測定，缺西洋參的陰性對照不干擾黃芪中黃芪甲苷的測定。理論板數以黃芪甲苷峰計算為12000，以人參皂苷Rb1峰計算為8300。色譜見圖1。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取1號貯備液和2號貯備液0.25、0.5、1、2、4 mL，分置5個10 mL容量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL注入液相色譜儀。以進樣濃度的常用對數（X）為橫坐標，峰面積的常用對數（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得黃芪甲苷的線性回歸方程為Y＝1.346X+6.965（r＝0.9989，n＝5）；人參皂苷Rb1的線性回歸方程為Y＝1.628X+6.756（r＝0.9991，n＝5）。結果表明，黃芪中黃芪甲苷和西洋參中人參皂苷Rb1的檢測濃度分別在0.0588～0.9408、0.1196～1.9135 mg·mL-1范圍內的對數值與各自峰面積的對數值呈良好線性關系。

圖1 高效液相色譜-蒸發光散射檢測圖A.和混合對照品；B.供試品；C.缺西洋參的陰性對照；D.缺黃芪的陰性對照；1.黃芪甲苷；2.人參皂苷Rb1Fig 1 HPLC-ELSD chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control without Panax quinque；D.negative control without Astragali Radix；1.astragalosideⅣ；2.ginsenoside Rb1

2.5 精密度試驗

2.5.1 中間精密度試驗 以不同的實驗人員在不同時間照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別制備3份，按上述方法分別測定后計算各指標含量。第一次測定結果黃芪甲苷的RSD＝4.0%（n＝3），人參皂苷Rb1的RSD＝0.67%（n＝3）；第二次測定結果黃芪甲苷的RSD＝4.24%（n＝3），人參皂苷Rb1的RSD＝1.06%（n＝3），表明該方法的中間精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取同一批（批號：20090910）樣品，按8、10、12 g稱量，每組3份，精密稱定，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別測定，計算各指標含量。結果，黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的RSD分別為3.4%和2.9%（n均為9），表明該方法重復性良好。

2.6 耐用性試驗

取樣品適量，照“2.2.2”項下方法平行制備3份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣：（1）以不同色譜柱[Agilent Eclipse-XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm ）、Waters Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）]進行測定，結果黃芪甲苷的RSD分別為3.6%和2.9%，人參皂苷Rb1的RSD分別為1.7%和1.6%。（2）以不同色譜柱溫度（35、40、45℃）進行測定，結果黃芪甲苷的RSD分別為3.1%、4.3%和3.9%，人參皂苷Rb1的RSD分別為2.0%、1.3%和2.1%。（3）以不同霧化器壓力（0.28、0.30、0.32 MPa）進行測定，結果黃芪甲苷的RSD分別為2.9%、2.4%和4.4%，人參皂苷Rb1的RSD分別為1.7%、2.3%和2.3%。（4）以不同漂移管溫度（35、40、45℃）進行測定，結果黃芪甲苷的RSD分別為3.2%、2.8%和3.2%，人參皂苷Rb1的RSD分別為2.7%、1.2%和1.8%，表明該方法的耐用性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液適量，分別于0、1、2、4、8 h進樣測定。結果，黃芪甲苷峰面積的RSD＝3.2%（n＝5），人參皂苷Rb1峰面積的RSD＝2.9%（n＝5），表明供試品溶液中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1在8 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已測定含量的樣品（批號：20090910，黃芪甲苷含量：0.1886 mg·g-1；人參皂苷Rb1含量：0.6551 mg·g-1）5 g，共9份，精密稱定，每3份分別精確加入低、中、高3種濃度的對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，測定含量，計算加樣回收率，結果分別見表2、表3。

表2 黃芪甲苷的加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests of astragalosideⅣ（n＝9）

表3 人參皂苷Rb1的加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests of ginsenoside Rb1（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定并計算含量，結果見表4。

表4 3批樣品含量測定結果Tab 4 Results of content determination of 3 batches of samples

2.10 制劑中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1穩定性考察

為考察制劑中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的穩定性，取3批樣品（批號：20100405、20100410、20100417）進行加速試驗考察。取模擬上市包裝樣品適量，置（40±2）℃、（75±5）%RH條件下貯藏，于0、1、2、3、6個月取樣，照含量測定方法檢測。結果，批號分別為20100405、20100410和20100417的樣品中黃芪甲苷的含量每袋分別為 1.030、1.210、0.992、1.180、0.983 mg，1.050、0.986、1.130、0.979、0.961 mg，1.060、1.220、1.150、0.985、0.972 mg；人參皂苷Rb1的含量每袋分別為4.01、3.94、4.12、3.89、4.19 mg，3.94、4.02、3.88、3.97、3.72 mg，4.18、4.25、4.08、4.04、4.11 mg。結果表明，經加速試驗6個月考察，制劑中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的含量無明顯變化，符合質量標準要求。

3 討論

3.1 色譜條件的優化

由于黃芪甲苷和人參皂苷Rb1為紫外末端吸收，采用200 nm左右的檢測波長時，雜質對色譜峰干擾大，而ELSD器對皂苷類化合物有較好的響應，故試驗選擇HPLC-ELSD法測定指標含量。為使黃芪甲苷和人參皂苷Rb1不受到雜質的干擾，需降低流動相中有機溶劑的比例，這卻使上述2種化合物的出峰時間延長、峰形變寬、檢測靈敏度降低，故參考有關文獻和試驗，以乙腈-水系統為流動相采用梯度洗脫，可使被測定成分與干擾物質較好地分離開來。

3.2 提取條件的考察

方中西洋參、黃芪是以提取物的形式存在于制劑中，其所含的黃芪甲苷和人參皂苷Rb1溶解于甲醇，因此采用甲醇為溶劑進行超聲提取；由于提取后直接測定時干擾物質多，故以氨試液溶解甲醇提取濃縮的殘渣后，再采用正丁醇萃取黃芪和人參皂苷Rb1，從而除去干擾雜質。

3.3 穩定性考察

在本制劑黃芪甲苷和人參皂苷Rb1穩定性考察試驗中，除對黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的含量測定外，還分別考察了性狀、鑒別、粒度、水分、溶化性、微生物限度，均符合質量標準要求，說明本品在6個月內質量穩定，直接接觸藥品的容器對藥品質量未見影響（長期試驗仍在進行中）。

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