核桃楸樹皮乙醇提取物乙酸乙酯相的質譜分析Δ

張詠莉，崔玉強，石志強，毛建文，李紅枝，林桂芳，冀軍鋒（.廣東藥學院，廣州市 50006；.廣州市黃埔區紅十字會醫院，廣州市 50760；.廣東中山市火炬開發區醫院，中山市 587；.廣東中山市尤利卡天然藥物有限公司，中山市 587）

核桃楸（Juglans mandshurica Maxim.）為胡桃科胡桃屬植物，屬落葉喬木，異名有山核桃（《東北常用中草藥手冊》）、馬核桃（《中國樹木分類學》）及楸馬核果（《中國藥用植物圖鑒》）等。核桃楸樹皮主要含有胡桃醌和大量的鞣質，以及苷類和多縮戊糖等[1]，核桃楸樹皮中可能還含有黃酮類、生物堿、酚類、蒽醌及強心苷等物質[2]。近幾年，不斷有學者從中分離出新的活性成分[3，4]，包括一些多酚及苷類成分，并顯示出較好的生物學功能[5，6]。筆者通過分級萃取、硅膠柱分離和質譜分析，初步探索了萃取相中活性較高的成分組成，為進一步開發和利用核桃楸樹皮的藥用成分提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPLC-Q-Tof MICRO MS型液相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀（美國Waters公司）；SB-5200DT型超聲波清洗機（寧波新芝儀器公司）；RE-52CS型真空旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；HH-2型數顯恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）；超純水儀（美國Milli-Q公司）；臺式高速離心機（德國Sigma公司）。

1.2 試藥

供試藥材采購自黑龍江省伊里嘎山，為曬干后天然制品，經黑龍江省藥材公司劉麗萍藥師鑒定為野生核桃楸（J.mandshurica Maxim.）樹皮。無水乙醇、甲醇采購自江蘇強盛化工有限公司，均為色譜純；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿均采購自天津富宇精細化工有限公司，均為分析純。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 萃取 將核桃楸樹皮粉碎，取500 g樹皮粉末用70%乙醇回流提取3次，第1次6 L回流3 h，后2次5 L回流2 h。合并提取液，減壓濃縮，收集浸膏。用5倍水溶解，抽濾，保存濾渣。濾液分別用乙醚、乙酸乙酯、飽和正丁醇萃取，各相萃取10次，每次300 mL，合并各萃取液，旋轉蒸發干燥。經過MTT細胞毒性篩查試驗，確定乙酸乙酯萃取相抗腫瘤活性較高，故選取乙酸乙酯相進一步細分。

2.1.2 硅膠柱分離 取乙酸乙酯萃取相500 mg，溶于1 mL甲醇中，12000 r·min-1離心去不溶物，得深褐色濃縮液，濕法氯仿裝柱，小心上樣，保持柱面平整，純氯仿洗脫，速度控制在每分鐘100滴左右，可見一淡黃色條帶出現，其后跟隨有橙紅色條帶下移，持續用氯仿洗脫分別合并洗脫液，旋轉蒸發濃縮，50℃真空干燥，分別得到供試品Ⅰ、Ⅱ。

2.1.3 MS條件 兩供試品均用甲醇溶解，MS設定條件為毛細管電壓：3500 V；錐孔電壓：20 V；離子能量電壓：2.0 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；碰撞能量電壓：10 V。

2.2 結果

乙酸乙酯萃取相經硅膠柱分離，分別得到2個條帶，條帶Ⅰ呈淡黃色，條帶Ⅱ呈橙紅色，分別收集濃縮。從陽離子質譜結果分析，兩供試品成分可能較為復雜，供試品I中2個主要成分的質譜分子量在317和437左右；樣品Ⅱ中3個主要成分的質譜分子量在303、437和453左右，其中質譜分子量303、317、437的組分在供試品Ⅰ和Ⅱ均有出現，詳見圖1、圖2。

圖1 供試品Ⅰ陽離子質譜圖Fig 1 Positive ion mass spectrum of sampleⅠ

圖2 供試品Ⅱ陽離子質譜圖Fig 2 Positive ion mass spectrum of sampleⅡ

3 討論

由陽離子質譜圖可以看出，本次分離的兩供試品Ⅰ和Ⅱ中，成分較為復雜，分子質量在303左右處，碎片峰有[M-H]－m/z 301，[M+H]+m/z 303，分子離子M+m/z 302。阮棟梁等[7]通過硅膠柱和葡聚糖凝膠柱層析，從沙棘葉子中分離并鑒定出黃酮類成分，并采用核磁和質譜分析技術對其結構進行了鑒定，并確認為是槲皮素。曾海波等[8]利用色譜技術從枸骨根中分離出1個黃酮類化合物，通過高分辨質譜以及核磁共振技術進行結構分析，表明該化合物是槲皮素。石建輝等[9]從核桃楸樹皮中分離出槲皮素，分子式為C15H10O7，分子量302.23。黃酮類化合物質譜圖中分子離子峰應為偶數，通常是以主峰的形式出現，而且必須是一個合理的分子量。如，黃酮、異黃酮類化合物分子量以222為基數；黃烷酮和查爾酮類化合物分子量為324；黃酮醇類化合物分子量為238；雙氫黃酮類化合物分子量為240等。每加一個-OH就要增加16個質量單位，以此類推。因此，判斷分子離子303[M+m/z 302]是黃酮醇類化合物增加了4個-OH。筆者由此推測供試品Ⅰ和Ⅱ中在303左右出峰的物質可能為槲皮素。在318左右處有碎片峰[M-H]－m/z 317，[M+H]+m/z 319，故分子離子為M+m/z 318，按照上述理論，M+m/z 318是黃酮醇類化合物增加了5個-OH。石建輝等[10]在核桃楸樹皮乙酸乙酯萃取相中也分離到一種分子量為318的淡黃色粉末成分，通過色譜及核磁方法鑒定為一種黃酮化合物C15H10O8，即楊梅苷。因此，可初步推定此處成分可能為楊梅苷。分子離子為437及453未能查到與現有文獻匹配，有可能是該樹皮醇提物中的新化合物，且其相差16，可能也為黃酮類化合物，相差一個-OH，其結構式見圖3。

圖3 2種黃酮類化合物結構式Fig 3 Structural formula of 2 kinds of flarvanoid compound

綜上所述，本研究采用醇提及溶劑分級萃取的方法提取核桃楸樹皮醇提物中的有效成分，并采用硅膠柱層析法進行分離純化，質譜法檢測成分，對氯仿洗脫下的2個條帶供試品進行了分析，推斷其可能含有的主要成分為槲皮素和楊梅苷，同時發現2個不明成分，有必要通過更進一步的方法進行分離檢測，從中分離得到新的成分。

[1]于海玲.核桃楸的研究進展[J].延邊大學醫學院學報，2005，28（2）：154.

[2]李敬芬，谷艷玲.核桃楸樹皮化學成分的研究[J].佳木斯醫學院學報，1994，17（6）：1.

[3]Machida K，Yogiashi Y，Matsuda S，et al.A new phenolic glycoside syringate from the bark of Juglans mandshurica MAXIM.var.sieboldiana MAKINO[J].J Natur Medic，2009，63（2）：220.

[4]Ngoc TM，Hung TM，Thuong PT，et al.Antioxidative activities of galloyl glucopyranosides from the stem-bark of Juglansmandshurica[J].Biosci Biotechnol Biochem，2008，72（8）：2158.

[5]崔玉強，張詠莉，林桂芳，等.核桃楸樹皮化學成分及藥物活性研究進展[J].海峽藥學，2010，22（1）：3.

[6]王金蘭，田孝平，郭洪利，等.山核桃樹皮中生理活性成分的研究[J].齊齊哈爾大學學報，2004，20（3）：7.

[7]阮棟梁，王 暉，李 和.沙棘葉槲皮素的分離鑒定[J].沙棘，2003，16（1）：26.

[8]曾海波，曾榮今，姚 飛.中藥枸骨根中槲皮素的提取分離與鑒定[J].湖南工程學院學報，2010，20（2）：60.

[9]石建輝，王金輝，袁 征，等.核桃楸皮的化學成分[J].沈陽藥科大學學報，2006，23（8）：501.