慢支咳喘膏的質量標準研究

陳瑤，肖芳，馮琳珊，肖鵬，董慧，劉祖祥，鄒啟發（.云南省第一人民醫院藥劑科，昆明市 650000；.云南白藥集團股份有限公司技術質量部，昆明市 650000）

慢支咳喘膏是云南省第一人民醫院臨床使用40余年的協定處方，由麻黃、黃芪、甘草、南沙參等藥材組成，具有益氣補肺、止咳化痰、平喘的功效，主要用于治療慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病等所致的久咳喘癥，效果顯著。本試驗對制劑中麻黃、黃芪、甘草3味藥材進行薄層色譜（TLC）鑒別，同時用高效液相色譜（HPLC）法測定了制劑中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽鹽酸麻黃堿的含量，旨在建立慢支咳喘膏質量控制的有效方法。

1 儀器與試藥

Agilent1100型HPLC儀，包括G1315B紫外檢測器、G1316A柱溫箱、G1313A自動進樣器、G1311A四元梯度泵、G1379A真空脫氣機、Agilent ChemStation工作站（美國Agilent公司）；薄層層析用硅膠G板（青島海洋化工有限公司，規格：100 mm×100 mm）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、黃芪甲苷、甘草酸銨對照品和甘草對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為0090-9801、1237-200103、0781-200311、100731-200615、120904-2004101）；黃芪、麻黃、甘草飲片（批號分別為100401、100601、100401）、樣品（批號：20100122、2010051820101025）及相應陰性樣品均由昆明道地中藥廠提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。理論板數按鹽酸麻黃堿色譜峰計算應＞6000。

2.2 定性鑒別

2.2.1 麻黃的TLC鑒別 取本品20 g，加10%氨水試液30 mL，充分混勻，加氯仿提取2次，每次40 mL，合并氯仿液，蒸干。殘渣加20%鹽酸1 mL溶解，作為供試品溶液；另取鹽酸麻黃堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液；取缺麻黃的陰性樣品2 g，同供試品制備方法制成陰性對照溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述3種溶液各5～10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-氨水（20∶3.5∶0.5）溶液為展開劑，展開8 cm，取出，晾干，噴以1%茚三酮溶液，加熱至斑點清晰。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同的紅色斑點；陰性對照無干擾。麻黃的TLC見圖1。

2.2.2 黃芪的TLC鑒別[1]取本品15 g，加甲醇40 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL，加熱使溶解，用乙醚提取3次，每次15 mL，棄去乙醚液，水層揮去乙醚，用水飽和的正丁醇提取3次，每次20 mL。合并正丁醇液，用正丁醇飽和的1%KOH溶液洗滌3次，每次15 mL，再用正丁醇飽和的水洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液；取缺黃芪的陰性樣品3 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述3種溶液各5～10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（6∶3∶0.5）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點清晰，置紫外光（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點；陰性對照無干擾。黃芪的TLC見圖2。

2.2.3 甘草的TLC鑒別[2]取本品10 g，加乙醚50 mL，超聲處理1 h，濾過，藥渣加甲醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗脫3次，每次20 mL，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液；另取甘草對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液；再取甘草酸銨對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺甘草的陰性樣品3 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶1∶3）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點清晰，置紫外光（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的黃綠色熒光斑點；陰性對照無干擾。甘草的TLC見圖3。

圖1 麻黃的TLC1～3.供試品；4.鹽酸麻黃堿對照品；5.陰性對照Fig 1 TLC of Herba Ephedrae1～3.test samples；4.ephedrinehydrochloridecontrol；5.negative control

圖2 黃芪的TLC1～3.供試品；4.黃芪甲苷對照品；5.陰性對照Fig 2 TLC of Astragalus membranaceus1～3.test samples；4.astra-galosideⅣ c ontrol；5.negative control

圖3 甘草的TLC1～3.供試品；4.甘草對照藥材；5.甘草酸銨對照品；6.陰性對照Fig 3 TLC of Radix Glycyrrhizae1～3.test samples；4.Radix Glycyrrhizae reference substance；5.ammonium glycyrrhetate control；6.negative control

2.3 含量測定

2.3.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對照品適量，精密稱定，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液制成每1 mL含鹽酸麻黃堿10μg和每1 mL含鹽酸偽麻黃堿30μg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品10 g，精密稱定，加水10mL和濃氨試液 7 mL，用乙醚振搖提取5次（30、30、30、20、20 mL），合并乙醚液，低溫回收至干，殘渣用乙醇3mL溶解并轉移至10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 按慢支咳喘膏的制法制備不含麻黃的提取物，照供試品溶液的處理方法制備溶液，即得。

2.3.4 系統適用性試驗和專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μL，注入色譜儀測定。結果，供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間處出現色譜峰；陰性對照無干擾。色譜見圖4。

圖4 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿Fig 4 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.ephedrine hydrochloride control；2.pseudoephedrine hydrochloride

2.3.5 線性關系考察 分別精密吸取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，對照品進樣量（X）為橫坐標，制備標準曲線，得麻黃堿、鹽酸麻黃堿的回歸方程分別為Y＝28.691X－3.4197（r＝0.9997）、Y＝74.026X－0.781（r＝0.9998）。結果表明，麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿進樣量在1.3～32.5、3.4～85μg范圍內與其峰面積積分值呈良好線性關系。

2.3.6 精密度試驗 分別吸取混合對照品溶液10μL，按上述色譜條件重復進樣6次，測定峰面積。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD分別為0.98%、0.76%，n均為6，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 取供試品溶液適量，分別于0、1、3、6、9、12 h按上述色譜條件測定。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD分別為0.94%、0.78%（n均為6），表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.8 重復性試驗 取同一批號樣品適量，共6份，按“2.3.2”項下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測定。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD分別為0.68%、0.99%（n均為6），表明方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量的樣品（批號：20101025）9份，各約5 g，精密稱定，分別依次精密加入0.1 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對照品溶液，使成為3個不同濃度的樣品，按“2.3.2”項下方法制成供試品溶液。照上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1、表2。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.10 樣品含量測定 取3批供試品溶液適量，按上述色譜條件測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量，結果見表2。

3 討論

黃芪的TLC鑒別中，曾采用超聲法處理樣品，但黃芪甲苷斑點不明顯；曾將提取液上中性氧化鋁柱純化樣品，黃芪甲苷斑點與雜質點重合，斑點也不明顯。本試驗中先用乙醚去雜質，再采用堿洗脫色；同時，由于正丁醇與水易發生乳化，所以先用正丁醇飽和堿液以加快洗脫；2005年版《中國藥典》中展開系統為氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）需低溫分層后使用，耗能耗時，故采用氯仿-甲醇-水（6∶3∶0.5）系統展開，方法簡單，Rf值適中。

表2 樣品含量測定結果Tab 2 Results of content determination of samples

甘草的TLC鑒別中，曾嘗試按2005年版《中國藥典》方法以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，但樣品中甘草酸銨對照品色譜相應位置有干擾，檢視不明顯，故采用本文中展開系統，甘草酸銨斑點清晰，無干擾。

本試驗中曾嘗試用氯仿作為提取溶劑制備供試品溶液，但乳化現象嚴重，損失量較大。而用濃氨水將樣品調至堿性后，用乙醚萃取，回收率良好。

方中麻黃作為君藥，具有發汗平喘的功效，用于治療痹痛有良好的抗炎、鎮痛效果[3]。鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿為麻黃中重要的化學成分，其中的鹽酸偽麻黃堿具有良好的抗炎、鎮痛作用[4，5]。為制定該制劑的質量標準，本研究選用鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿作為檢測指標，以HPLC法測定2種成分的含量。本試驗中采用乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）為流動相，經方法學考察，此方法簡單，專屬性強、分離度好、且保留時間適宜，重現性、穩定性以及加樣回收率良好。

[1]謝虞升，李漢保，宋炳生.對1995版黃芪薄層鑒別法的探討[J].中草藥，1999，3（30）：192.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄31、59.

[3]高嘩珩，黨力納.麻黃研究進展[J].陜西中醫學院學報，2003，6（20）：60.

[4]吳桂榮，王曉文.偽麻黃堿水楊酸鹽的藥用研究——鎮痛、抗炎及對胃黏膜的刺激的考察[J].藥學進展，2000，24（2）：107.

[5]吳桂榮，王曉文.偽麻黃堿水楊酸鹽的藥用研究——解熱、對心率和血壓及組胺所致刺激反應的影響[J].藥學進展，2000，24（4）：238.