吻合口位置對(duì)周圍神經(jīng)端側(cè)吻合術(shù)后神經(jīng)再生的影響

楊立民，李秀華，張基仁，齊 勇，肖 強(qiáng)，張彩順，吳月欣

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

外周神經(jīng)損傷在臨床上較常見。受損神經(jīng)斷端不能直接吻合或近端無(wú)法尋找時(shí)，常采用神經(jīng)移植或移位的方法來(lái)修復(fù)，但均以損傷供體神經(jīng)功能為代價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)［1，2］，再生神經(jīng)功能恢復(fù)與再生神經(jīng)纖維的性質(zhì)關(guān)系密切?；旌仙窠?jīng)端側(cè)吻合后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能恢復(fù)仍不滿意。為此，我們于2009年10月設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，即通過(guò)對(duì)供體神經(jīng)干不同端側(cè)吻合口位置的選擇，觀察吻合口位置對(duì)神經(jīng)端側(cè)吻合術(shù)后再生神經(jīng)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康新西蘭大白兔58只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄不限(遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)。按手術(shù)先后隨機(jī)分為定位組(10只)和A、B 組(各24只)。

1.2 手術(shù)方法 ①神經(jīng)干功能束鑒定:定位組10只麻醉后，雙側(cè)后肢后外側(cè)縱行切口，暴露脛神經(jīng)及脛神經(jīng)第1肌支，顯微鏡下于第1肌支分支前的脛神經(jīng)做外膜下縫線標(biāo)記。切取標(biāo)記的脛神經(jīng)干1 cm，遠(yuǎn)、近端標(biāo)記后移入低溫恒冷切片機(jī)中，分別于遠(yuǎn)端斷面下 0.3、0.5、0.8 cm 處連續(xù)切片，乙酰膽堿酯酶免疫組織化學(xué)染色鑒定，光鏡下觀察，確定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維集中位置和混合神經(jīng)集中位置(以此確定A、B組神經(jīng)端側(cè)吻合口位置)［3］。脛神經(jīng)第1肌支分叉至其上0.5 cm處，光鏡下見神經(jīng)外膜標(biāo)記側(cè)為染色較深的有髓神經(jīng)纖維，而其對(duì)側(cè)為無(wú)色或淡染的無(wú)髓神經(jīng)纖維團(tuán)塊及深染的有髓神經(jīng)纖維混合分布，提示神經(jīng)外膜標(biāo)記側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維較集中，其對(duì)側(cè)多為混合神經(jīng)纖維(提示A組吻合口應(yīng)設(shè)在脛神經(jīng)第1肌支分叉至其上0.5 cm處神經(jīng)外膜標(biāo)記側(cè)，B組吻合口應(yīng)在其對(duì)側(cè))。②模型制作:A、B組麻醉后，暴露雙側(cè)脛神經(jīng)及腓總神經(jīng)，切斷腓總神經(jīng)遠(yuǎn)端，建立腓總神經(jīng)損傷模型。③神經(jīng)吻合部位及方法:腓總神經(jīng)近端結(jié)扎翻轉(zhuǎn)縫于臨近肌肉上，遠(yuǎn)端剪成45°斜面，A組于脛神經(jīng)第1肌支分叉至其上0.5 cm處神經(jīng)外膜標(biāo)記側(cè)參照文獻(xiàn)［4］的方法行腓總神經(jīng)遠(yuǎn)端與脛神經(jīng)干端側(cè)吻合術(shù)，B組于脛神經(jīng)第1肌支分叉至其上0.5 cm處神經(jīng)外膜標(biāo)記對(duì)側(cè)行端側(cè)吻合術(shù)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 術(shù)后1、2、3個(gè)月，A、B組分別取動(dòng)物每次各8只，觀察以下指標(biāo):①腓總神經(jīng)電生理檢查，觀察腓總神經(jīng)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)潛伏期和振幅;②完整取出脛骨前肌，測(cè)肌肉濕重，稱重后切取脛骨前肌中段深部肌束，石蠟包埋、切片、HE染色，觀察肌肉最大橫徑處的橫切面，用CIAS-1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測(cè)定肌纖維截面積;③取神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)端0.5 cm的腓總神經(jīng)，甲醛固定，石蠟包埋，切片后甲苯胺藍(lán)染色。顯微鏡觀察、圖像分析儀測(cè)定有髓神經(jīng)纖維數(shù)和神經(jīng)束截面積;④取吻合口遠(yuǎn)端1.5 cm腓總神經(jīng)，采用免疫組化染色觀察神經(jīng)絲蛋白(NF)表達(dá)情況。PBS代替一抗做陰性對(duì)照。NF陽(yáng)性表達(dá)為黃色或棕黃色。每組取切片5張，每張切片隨機(jī)取2個(gè)高倍視野進(jìn)行平均灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 A、B組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)腓總神經(jīng)CMAP檢查結(jié)果 隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組CMAP潛伏期均逐漸縮短、波幅逐漸增大(P均＜0.05)。詳見表1。

2.2 A、B組脛骨前肌濕重及肌纖維截面積測(cè)定結(jié)果 隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，兩組肌濕重及肌纖維截面積均逐漸增加，且A組高于B組(P均＜0.01)。詳見表2。

表1 A、B組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)腓總神經(jīng)CMAP潛伏期及波幅比較(±s)

表1 A、B組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)腓總神經(jīng)CMAP潛伏期及波幅比較(±s)

注:與B組同一時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.01

組別 潛伏期(ms)術(shù)后1個(gè)月 術(shù)后2個(gè)月 術(shù)后3個(gè)月波幅(mV)術(shù)后1個(gè)月 術(shù)后2個(gè)月 術(shù)后3個(gè)月A 組 4.64 ±0.28* 3.46 ±0.07* 1.77 ±0.05* 2.92 ±0.06* 5.64 ±0.07* 8.77 ±0.05*B 組 6.25 ±0.28 4.86 ±0.18 2.86 ±0.05 1.64 ±0.07 4.05 ±0.06 6.93 ±0.10

表2 A、B組不同時(shí)點(diǎn)肌濕重及肌纖維截面積的變化(±s)

表2 A、B組不同時(shí)點(diǎn)肌濕重及肌纖維截面積的變化(±s)

注:與 B 組比較，*P ＜0.01

組別 肌濕重(g)術(shù)后1個(gè)月 術(shù)后2個(gè)月 術(shù)后3個(gè)月肌纖維截面積(μm2)術(shù)后1個(gè)月 術(shù)后2個(gè)月 術(shù)后3個(gè)月A 組 1.57 ±0.03* 1.87 ±0.05* 2.81 ±0.07* 1 194.10 ±38.67* 1 249.64 ±33.64* 1 525.79 ±55.56*B 組 1.23 ±0.05 1.47 ±0.303 2.04 ±0.05 1 044.20 ±43.55 1 065.16 ±54.92 1 378.59 ±46.57

2.3 A、B組有髓神經(jīng)纖維數(shù)目及其截面積測(cè)定結(jié)果 兩組術(shù)后切取腓總神經(jīng)時(shí)，足部有明顯抽動(dòng)(提示再生神經(jīng)通過(guò)吻合口并到達(dá)其所支配的肌肉)。吻合口處神經(jīng)完整，局部與周圍組織有輕度粘連。隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，兩組有髓神經(jīng)數(shù)目及再生神經(jīng)截面積均有所增加，且A組均高于B組(P均＜0.01)。詳見表 3。

2.4 A、B組再生纖維中NF表達(dá)變化 隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，NF表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，且術(shù)后2、3個(gè)月時(shí)，A組強(qiáng)于B組(P均＜0.05)。詳見表4。

表3 A、B組不同時(shí)點(diǎn)有髓神經(jīng)纖維數(shù)目及截面積的變化(±s)

表3 A、B組不同時(shí)點(diǎn)有髓神經(jīng)纖維數(shù)目及截面積的變化(±s)

注:與B組同一時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.01

組別 有髓神經(jīng)纖維數(shù)目(條)術(shù)后1個(gè)月 術(shù)后2個(gè)月 術(shù)后3個(gè)月再生神經(jīng)纖維束截面積(μm2)術(shù)后1個(gè)月 術(shù)后2個(gè)月 術(shù)后3個(gè)月A 組 41.48 ±3.62* 185.56 ±12.93* 458.38 ±18.80* 8.63 ±0.44* 10.07 ±0.45* 15.52 ±0.44*B 組 30.85 ±3.25 142.54 ±16.12 410.10 ±16.53 6.71 ±0.37 8.29 ±0.32 11.51 ±0.50

表4 A、B組組不同時(shí)點(diǎn)再生神經(jīng)中NF表達(dá)(灰度值，±s)

表4 A、B組組不同時(shí)點(diǎn)再生神經(jīng)中NF表達(dá)(灰度值，±s)

注:與B組同一時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05

組別NF術(shù)后1個(gè)月 術(shù)后2個(gè)月 術(shù)后3個(gè)月A 組 170.83 ±6.01 152.80 ±12.68* 139.76 ± 7.75*B組173.46 ±8.72 161.20 ± 9.00 147.27 ±12.70

3 討論

目前研究結(jié)果顯示［5，6］，外周神經(jīng)端側(cè)吻合后，影響神經(jīng)再生的因素除吻合質(zhì)量外，尚有供體神經(jīng)干外膜開窗、吻合口角度、遠(yuǎn)端受體神經(jīng)的預(yù)變性及吻合口功能束性質(zhì)等。盡管許多研究中都采用有利于神經(jīng)再生的方法，但混合神經(jīng)間端側(cè)吻合后，患肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)仍不理想［7，8］，考慮其原因是否與吻合口處供體神經(jīng)干功能束性質(zhì)不同有關(guān)。

本研究中A組吻合口位于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維集中處，B組吻合口則位于其對(duì)側(cè)混合神經(jīng)纖維集中處。光鏡下見神經(jīng)外膜標(biāo)記側(cè)為染色較深的有髓神經(jīng)纖維，而其對(duì)側(cè)為無(wú)色或淡染的無(wú)髓神經(jīng)纖維團(tuán)塊及深染的有髓神經(jīng)纖維混合分布，提示神經(jīng)外膜標(biāo)記側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維較集中，其對(duì)側(cè)多為混合神經(jīng)纖維。結(jié)合顯微鏡下解剖定位，我們?cè)O(shè)分叉上0.5 cm處神經(jīng)外膜標(biāo)記側(cè)為A組吻合口，其對(duì)側(cè)為B組吻合口位置。通過(guò)術(shù)后連續(xù)3個(gè)月的電生理、組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，兩組再生神經(jīng)誘發(fā)電位的潛伏期逐漸縮短，波幅逐漸增大，提示兩組神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)。A組恢復(fù)程度明顯優(yōu)于B組。

NF是一種穩(wěn)定的多聚體，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架，它決定軸突的直徑，并參與軸突的快速轉(zhuǎn)運(yùn)和慢速轉(zhuǎn)運(yùn)，決定電信號(hào)的傳導(dǎo)速度。本實(shí)驗(yàn)中A組再生纖維中NF陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度優(yōu)于B組，進(jìn)一步說(shuō)明A組再生神經(jīng)質(zhì)量?jī)?yōu)于B組。證明外周神經(jīng)端側(cè)吻合時(shí)再生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維與吻合口位置關(guān)系密切，即吻合口位于神經(jīng)干運(yùn)動(dòng)束集中處，再生神經(jīng)中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維數(shù)量多，成熟度高，其所支配肌肉的功能恢復(fù)較好。

雖然目前神經(jīng)端側(cè)吻合術(shù)尚不能代替神經(jīng)端端吻合術(shù)而普遍用于臨床，但前者具有不切取自體神經(jīng)亦不損傷供體神經(jīng)功能、操作簡(jiǎn)單靈活等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于長(zhǎng)段神經(jīng)缺損及無(wú)法尋找近端的損傷神經(jīng)，進(jìn)行神經(jīng)端側(cè)吻合術(shù)，吻合口可設(shè)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維集中處，術(shù)后可有效防止失神經(jīng)肌肉萎縮，恢復(fù)神經(jīng)移植或移位后供體神經(jīng)的功能，因此我們認(rèn)為該手術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

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