熱休克蛋白HSP27和HSP70在老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中表達及其意義

李桂榮,周鴻雁,張文松*

(1.吉林大學第二醫院眼科醫院,吉林長春130041;2.吉林大學中日聯誼醫院眼科)

近年來,熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)對細胞的保護作用以及在細胞凋亡的調節方面受到了廣泛的關注。但在晶狀體中的研究較少。我們利用RT-PCR方法觀察了HSPs的兩種類型:HSP70和HSP27基因在老年性白內障和正常人晶狀體上皮細胞中的表達情況,以探討這兩個基因與老年性白內障發生的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗組為北京朝陽醫院2005年老年性白內障患者晶狀體的前囊膜,共42眼(男26眼,女16眼)均為不同年齡的老年性白內障,平均年齡63.4歲±8.2歲,實驗的對照組為健康成年眼球晶狀體的前囊膜,共15例,為青壯年。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、dNTPs(10 mM)、Taq 酶(2 U/μ l)、β-Actin(25 pmol/μ l)。均為北京鼎國生物技術有限公司的產品。

1.1.3 引物 從PUBMED/Nucleotide GenBank中查出人HSP70、HSP27基因全序列,β-actin序列作為內參照。應用Primer Premier 5.0設計引物。

引物由北京奧科生物公司合成。序列如下:HSP70 上 游 引 物 :5′-GTACAGAAAGACATTAAAAAT-3′,下 游 引 物 :5′-TCAGGGTCGAATAAAGTTACT-3′。擴增產物長度為 200 bp。HSP27上游引物:5′-GCGAATTCCCTGCTAAAAATACCCGACT-3′;下 游引 物 :5′-GCAGCTGGATGCCCACCCCTGC-3′。擴增產物長度為 295 bp。 β-actin 上 游 引 物:5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′;下 游 引 物:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。擴增產物長度為506 bp。

1.2 方法

提取兩組晶狀體前囊膜中總RNA,并以此逆轉錄成cDNA。

以β-actin作為內參,將其與待測得目的基因同時擴增,分兩管相同體系進行。按PCR試劑盒說明書操作。

瓊脂糖電泳分別取兩管反應管中5 μ l擴增產物和上樣緩沖液0.3 μ l點樣后90 V電泳1 h,凝膠用紫外凝膠成像系統觀察,并進行半定量分析。圖像分析儀測照片上擴增產物的平均灰度,計算出其基因表達量與其對應的內參β-actin表達量的比值。

1.3 統計學處理

應用SPSS11.0軟件包進行統計分析,各組兩兩比較采用方差分析,取P＜0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 HSP27mRNA在老年性白內障與正常對照的LECs的表達情況

HSP27mRNA在老年性白內障與正常對照的LECs的表達如圖1所示,HSP27基因和內參β-actin分別擴增基因片段。1-5為老年性白內障晶狀體上皮細胞的HSP27基因的擴增產物,6-7為正常對照的晶狀體上皮細胞的HSP27基因的擴增產物。老年性白內障中HSP27基因擴增的產物為295 bp,β-actin擴增的產為506 bp。圖像分析儀測瓊脂糖凝膠上HSP27/β-actin擴增產物的平均灰度,其基因表達量與其對應的β-actin表達量的比值,老年性白內障組為0.418±0.275,正常晶狀體前囊膜組為0.147±0.006,兩組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

圖1 HSP27mRNA在老年性白內障與正常對照的LECs的表達情況

2.2 HSP70mRNA在老年性白內障與正常對照的LECs的表達情況

HSP70mRNA在老年性白內障與正常對照的LECs的表達如圖2所示,1-2為老年性白內障晶狀體上皮細胞的HSP70基因的擴增產物,3-5為正常對照的晶狀體上皮細胞的HSP70基因的擴增產物。老年性白內障中HSP70基因擴增的產物為200bp,βactin擴增的產為506 bp。圖像分析儀測瓊脂糖凝膠上HSP70/β-actin擴增產物的平均灰度,其基因表達量與其對應的β-actin表達量的比值,老年性白內障組為0.80±0.14,正常晶狀體前囊膜組為0.38±0.01,兩組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

圖2 HSP70mRNA在老年性白內障與正常對照的LECs的表達情況

3 討論

近年來的研究表明,晶狀體能表達一系列的熱休克蛋白(HSPs)。它們對維持晶狀體的穩定和透明起到關鍵作用[1]。其中HSP70,HSP27與白內障關系最為密切。

HSP70在正常細胞中水平較低,而在應激后表達顯著增高。Li等研究顯示HSP70通過抑制線粒體細胞色素C的釋放及Caspase-3的活化而抑制細胞凋亡[2]。Dean等[3]的研究認為,正常的生理環境,例如光照等,對于晶狀體來說亦是一種特殊的應激狀態,可以誘導HSP的產生。HSP 70的表達增加有利于晶狀體細胞內蛋白質的正確構象,維持晶狀體的透明性,延緩和減輕白內障的發生。

HSP27是小分子熱休克蛋白家族中重要的一員,廣泛存在于人類細胞中,對維持晶狀體的透明性有重要意義。其功能主要表現在分子伴侶功能:阻止蛋白間不必要的相互作用;幫助變性蛋白重新折疊[4]。此外,對損傷細胞具有修復及保護作用[5],通過Fas/APO1受體參與細胞凋亡[6]。近年來,HSP27在晶狀體中的研究日益受到重視。Hawse等[7]在鎘、銅等有害金屬的作用下,應用逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)對熱休克蛋白基因進行檢測,結果發現晶狀體上皮細胞的α-B晶體蛋白,HSP27等小分子熱休克蛋白表達增高,推論HSP27對金屬誘導的應激反應具有細胞保護的作用。

老年性白內障是最為常見的白內障類型,多見于50歲以上的中老年人,隨年齡的增加其發病率升高。它是晶狀體老化后的退行性變,是多種因素作用的結果。本實驗研究了42例老年性白內障患者與15例正常對照眼,其晶狀體前囊膜上皮細胞均發現了HSP的表達,但其表達量不同。老年性白內障患者HSP27、HSP70mRNA表達較正常對照組高,且兩者之間的差異達到了顯著水平(P＜0.05)。通過本研究,可以得出,HSP27、HSP70在老年性白內障的發生和發展中起了重要的作用,為老年性白內障的預防與臨床治療提供了理論依據。

[1]Berry Y.Alpha-B crystalline gene(CRYAB)mutation causes dominant congenital posterior polar cataract in human[J].Am J Hum Genet,2001,69:1141.

[2]Li CY,Lee JS,Ko YG.Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome C release and upstream of Caspase-3 activation[J].J Biol Chem,2000,275(5):25665.

[3]Dean DO,Kent CR,Tytell M.Constitutive and inducible heat shock protein70 immunoreactivity in the normal rat eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40:2952.

[4]Haslbeck M.Recombinant expression and in vitro refolding of the yeast small heat shock protein Hsp42[J].Int J Biol Macromol,2006,38(2):107.

[5]Krueger-Naug AM,Emsley JG,Myers TL,et al.Injury to retinal ganglion cells induces expression of the 8iIl-heat shock protein Hsp27 in the rat visual system[J].Neurescience,2002,110(4):653.

[6]張書霞,華榮虹,鮑恩東.熱應激對雞胸腺細胞凋亡的影響及其調節機理[J].南京農業大學學報,2003,26(1):66.

[7]Hawse JR,Cumming JR,Oppermann B,et al.Activation of metallothioneins and alpha-crystallin/HSPs in human lens epithelial cells by specific metals and the metal content of aging clear human lenses[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44(2):672.