CIK治療前后腫瘤患者外周血CD4+CD25+調節型T細胞變化研究

李 敏,鄧海峰,陸明洋,徐 斌,鄭 曉,劉 檢,吳 駿,季 枚,周 怡,孫 青,吳昌平,蔣敬庭

(蘇州大學附屬第三醫院腫瘤生物診療中心,江蘇常州213003)

腫瘤局部存在多種類型的免疫抑制性細胞,它參與腫瘤患者的細胞免疫與腫瘤的發生、發展密切相關。其中 CD4+CD25+T細胞(regulatory T cell,Treg)是一類具有獨特免疫調節功能的T淋巴細胞亞群,一般占人外周血CD4+T細胞的5%-10%[1,2]。近年來,國內外對這類調節性T細胞的研究已從自身免疫耐受、移植免疫逐漸擴展到腫瘤免疫,認為CD4+CD25+調節型T細胞是形成腫瘤免疫耐受的關鍵成分[3]。由細胞因子激活的殺傷細胞(Cytokine-induced killer cells,CIK)是可直接殺傷腫瘤細胞的一類新型抗腫瘤效應細胞,并且可調節和增強機體的免疫功能。本課題組曾系列報道了胃癌患者采用化療聯合CIK細胞治療后機體的腫瘤標志物水平、細胞免疫功能變化、近期療效觀察及副反應等[4-8]。

我們利用流式細胞儀檢測了28例腫瘤患者外周血CD4+CD25+調節型T細胞的表達,分析腫瘤的發生與CD4+CD25+調節型T細胞表達的關系,評價CD4+CD25+調節性T細胞在腫瘤的免疫抑制方面所起的作用。同時觀察經CIK治療后患者CD4+CD25+調節型T細胞表達的變化,為評估CIK細胞治療及尋求新的免疫治療途徑提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 臨床確診的中晚期腫瘤患者28例(腫瘤組),胃癌18例,結腸癌4例,原發性肝癌4例,乳腺癌 2例。男20例,女8例;平均年齡(60±9)歲。CIK治療一個療程后3個月采外周血檢測。選擇健康成年人30例為對照,男15例,女15例,平均年齡(51±10)歲。

1.2 儀器及主要試劑 流式細胞儀EPICS XL(美國貝克曼庫爾特公司),鼠抗人單克隆抗體CD4-PE,CD25-PC5,CD3FITC/CD56-PE,CD3-FITC/CD8PE及IgG1同型對照抗體(蘇州基因生物技術有限公司)。基因重組人白細胞介素2(rhIL-2)(山東泉港藥業有限公司);基因重組γ干擾素(IFN-γ)(上海克隆生物高技術有限公司);淋巴細胞分離液(上海試劑二廠);RPMI 1640(美國GIBCO公司)。

1.3 CIK細胞的制備及回輸 分離外周血PBMC用含 10%人AB血清、25 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640調至起始密度2.0×106/L。于第 0天加入 1 000 U/ml γ-IFN,置于 37℃5%CO2培養箱培養,24 h后加入rhIL-1α 100 U/ml,CD3McAb 50 ng/ml,rhIL-2 800-1 000 U/ml繼續培養。以后根據培養情況添加含 rhIL-1α100 U/ml,CD3McAb 50 ng/ml,rhIL-2 800-1 000 U/ml的RPMI1640完全培養液,并調整細胞密度為2×106/ml。CIK細胞培養至14-28天,取少許培養細胞做流式細胞儀檢測,當CD3+CD56+細胞數≥50%,CD3+CD8+細胞≥30%且細菌及真菌培養陰性時即收集細胞。經生理鹽水洗滌3次,加入1%人血白蛋白生理鹽水中回輸。一般為隔天回輸一次,一個療程共回輸5次,回輸細胞總數為1.6×1010以上。

1.4 FCM標本的制備及檢測 取肝素抗凝外周血100 μ l,分別加入熒光標記的抗體各 10 μ l,4℃避光孵育30 min,加入溶血素 500 μ l混勻,室溫溶血15 min,離心棄上清后各加入2 ml PBS洗滌2遍,最后加入500 μ l PBS混勻,10 min后上機檢測。

1.5 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件進行數據統計分析。各組檢測結果以±s表示,組間差別采用t檢驗進行統計學差異性分析,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組與正常對照組外周血 CD4+CD25+T細胞表達流式分析 分別為(9.30±2.99)和(6.43±2.45)均明顯高于正常對照組(5.01±1.69)(P＜0.05)。見圖1。

圖1 流式細胞檢測CIK治療前后腫瘤組與對照組外周血CD4+CD25+T細胞表達

2.2 腫瘤患者在 CIK治療前及治療后其外周血CD4+CD25+T細胞表達 CIK治療前后腫瘤患者CD4+CD25+T細胞表達分析如表1所示,CIK治療后患者外周血CD4+CD25+T細胞表達明顯低于治療前,其差別有統計學意義(P＜0.05)。

CIK治療前后腫瘤患者外周血CD4+CD25+T細胞表達變化與患者性別無關;治療前年齡較低(41-60)組患者外周血CD4+CD25+T細胞表達低于年齡較高(61-80)組,而治療后兩年齡組間差異無統計學意義。

表1 CIK治療前后腫瘤組與對照組外周血CD4+CD25+T細胞表達測定

3 討論

Treg在體內具有很強的免疫抑制作用,清除腫瘤患者體內的Treg有望改善患者的免疫功能。大量研究表明,在眾多腫瘤患者外周血淋巴細胞中均有CD4+CD25+T細胞增多[9]。CD4+CD25+T細胞能夠通過CTLA-4依賴的直接細胞接觸抑制方式和分泌抑制性細胞因子如TGF-β或IL-10來抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化和增殖及分泌IL-2的能力[10,11]。由于CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群是機體抗腫瘤免疫應答過程中的主要效應細胞,因此CD4+CD25+T細胞的免疫抑制功能導致腫瘤局部或循環中T細胞功能紊亂從而抑制了腫瘤患者的抗腫瘤細胞免疫應答。由此可以認為CD4+CD25+T細胞比例增加成為導致腫瘤患者細胞免疫功能削弱的機制之一。

研究表明,移植白血病細胞之前輸入去除CD25+T細胞的脾細胞懸液,大多數BALB/C裸鼠生長腫瘤在一月內自行消退,并且能長期生存。在第二次大劑量移植白血病細胞后,該裸鼠排斥腫瘤細胞的反應更快更激烈,說明它們產生了腫瘤特異性CTL。Steitz等研究發現,在體內去除CD25+T細胞可產生兩種效應細胞,一種為CD8+CTL,其作用是抗原特異性的;另一種是CD4-CD8+T細胞,如NK細胞,無須抗原刺激而起作用,共同激發有效的腫瘤免疫。與此相似,在體外無瘤刺激環境中培養去除CD4+CD25+T細胞的脾細胞懸液,也能誘導上述兩種細胞的產生。在B16黑色素瘤小鼠中,通過抗CD4抗體,去除CD4+T細胞可使腫瘤生長遲緩,由此可以推測CD4+CD25+T細胞比例的升高可能是腫瘤特異性免疫下調的關鍵。

CIK細胞是人外周血單個核細胞在體外經多種細胞因子刺激后獲得的一群異質細胞,它具有增殖能力強、殺瘤活性高和殺瘤譜廣、臨床應用副作用小的特點,是腫瘤過繼免疫治療中更為有效的殺瘤效應細胞。CIK細胞是一種非MHC(組織相容性抗原)和非T細胞受體限制性的免疫活性細胞,其主要效應細胞為CD3+CD56+細胞。為進一步了解腫瘤患者的免疫功能以及CIK細胞治療對腫瘤患者免疫功能的影響,本研究對28例腫瘤患者經CIK細胞治療前后,其外周血CD4+CD25+T細胞比例進行檢測,結果顯示:相對于健康者,腫瘤患者外周血中CD4+CD25+T細胞表達率顯著增高。這一結果表明,在腫瘤患者中CD4+CD25+T細胞發揮了免疫抑制作用,從而使機體不能很好發揮抗腫瘤免疫應答作用,這在一定程度上進一步加速了腫瘤的發展。在經過CIK細胞治療后,腫瘤患者外周血中CD4+CD25+T細胞比例較治療前明顯降低,但仍高于健康者。由此可見,CIK細胞治療可以在一定程度上提高患者的免疫功能。但是,盡管治療后患者的細胞免疫抑制狀態得到了一定程度的解除,免疫功能逐步得到改善,機體處于一種活躍的免疫狀態中,但患者的免疫狀態仍然低下。因此,如何在更大程度上消除CD4+CD25+T細胞對患者免疫功能抑制的影響,成為腫瘤生物治療中一個需要重點解決的問題。

總之,隨著對CD4+CD25+T細胞研究的進一步深入,通過特異性或非特異性清除Treg、控制Treg的數量和功能等開展腫瘤免疫治療必將為腫瘤免疫治療提供更多的策略。

作者簡是:李敏,女,33歲,碩士,助理研究員,研究方向:腫瘤生物治療。

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