慢性乙型肝炎和肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌TIMP-1的研究

王恩波,丁榮梅,李興華

(連云港市第一人民醫(yī)院輸血科,江蘇連云港222002)

本研究通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清和單個(gè)核細(xì)胞中組織金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)的分析,探討TIMP-1在肝纖維化中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 病例的選擇 病例組為2006年7月至2008年7月在我院住院的患者,慢性乙型肝炎63例,其中男42例,女21例,平均年齡39(20-69)歲;乙型肝炎肝硬化47例,男27 例,女 20例,平均年齡56(41-77)歲,診斷按2000年9月中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分型,所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒合并感染。對(duì)照組是體檢健康且乙型肝炎標(biāo)志物陰性40例,男25例,女15例,平均年齡35(27-48)歲。

1.2 主要試劑和儀器 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于CEDARLANE,1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)于GIBCO,胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司,刀豆蛋白A(ConA)購(gòu)于SIGMA公司,組織金屬蛋白酶抑因子1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 ELISA試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。MCO-17AC CO2培養(yǎng)箱(SANYO)。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 抽取健康對(duì)照、慢性乙型肝炎和肝硬化患者靜脈血5 ml,應(yīng)用Ficoll分離液密度梯度離心分離PBMC,用1640培養(yǎng)基洗滌PBMC3次,每次800 rpm/min離心10分鐘,用1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml,取細(xì)胞懸液加入96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中,200 μ l/孔,每個(gè)標(biāo)本加3個(gè)復(fù)孔,每孔加入刀豆蛋白A至終濃度5 μ g/μ l,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中共同孵育72 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)TIMP-1的含量。

1.4 血清TIMP-1、TGF-β1和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TIMP-1的含量檢測(cè) 應(yīng)用博士德人組織金屬蛋白酶抑因子1 ELISA試劑盒檢測(cè)血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TIMP-1的含量,博士德人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 ELISA試劑盒檢測(cè)血清TGF-β1的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理,均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以±s表示;PBMC中 TIMP-1含量與血清TGF-β1的關(guān)系采用二元變量的相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 血清和PBMC培養(yǎng)上清中TIMP-1蛋白含量的比較 見(jiàn)表1。

表1 血清和PBMC培養(yǎng)上清中TIMP-1蛋白含量

2.2 血清 TGF-β1含量、血清 TIMP-1與 TGF-β1含量相關(guān)性分析 慢性乙型肝炎組(12.05±2.62)ng/ml和肝硬化組(13.91±3.04)ng/ml兩組血清TGF-β1蛋白含量均明顯高于正常對(duì)照組(6.15±2.31)ng/ml;血清TIMP-1與TGF-β1含量呈明顯正相關(guān)(r=0.71,P＜0.01)。

3 討論

慢性乙型肝炎病人血清TIMP-1升高主要是由于長(zhǎng)期慢性肝臟炎癥,TGF-β1、IL-1、TNF-α等合成和分泌增加,這些炎癥因子促使了TIMP-1的表達(dá),尤其是肝臟損傷時(shí),肝星狀細(xì)胞(HSC)通過(guò)自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生大量的TGF-β1,激活的TGF-β1通過(guò)與細(xì)胞膜上的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體結(jié)合發(fā)揮作用,促使Ⅰ、Ⅲ型膠原,纖維連接蛋白及其mRNA均呈劑量依賴性增加,同時(shí)TGF-β1通過(guò)促進(jìn)HSC分泌TIMP-1抑制膠原酶的mRNA的表達(dá)進(jìn)而減少ECM的分解,在我們檢測(cè)的慢性肝臟病病人中,血清TGF-β1含量明顯增高。張連峰[1]等人檢測(cè)了慢性乙型肝炎患者血清TGF-β1和TIMP-1在肝纖維化不同階段的表達(dá)情況,通過(guò)肝穿刺對(duì)肝纖維化進(jìn)行病理分級(jí),發(fā)現(xiàn)血清TGF-β1、TIMP-1在肝纖維化早期即明顯升高,且隨肝纖維化程度的加重 TGF-β1、TIMP-1逐漸升高,因此認(rèn)為血清TIMP-1含量對(duì)肝纖維化的診斷中具有較高的價(jià)值。Fontana[2]等人建立了包含血清TIMP-1、HA和血小板個(gè)數(shù)的三變量數(shù)學(xué)模型,在診斷肝硬化時(shí),ROC曲線下面積達(dá)到0.81,診斷價(jià)值明顯優(yōu)于APRI(曲線下面積為0.73)和肝硬化積分(曲線下面積為0.70)等模型,多變量分析提示血清TIMP-1、HA含量與肝臟纖維化Ishak積分呈正相關(guān),血清TIMP-1、HA與肝臟膠原直接定量分析相比更能準(zhǔn)確的反應(yīng)肝臟纖維化的程度。

對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液TIMP-1含量檢測(cè)表明,單個(gè)核細(xì)胞合成的TIMP-1含量較低,且慢性乙型肝炎和肝硬化組單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清TIMP-1含量與正常組比較,差別無(wú)顯著性意義,進(jìn)一步證明血清中的TIMP-1主要來(lái)源于活化的HSC,對(duì)大鼠慢性肝損傷的研究表明[3],TIMP-1的持續(xù)高表達(dá)與HSC的持續(xù)激活相關(guān)。總之,在慢性肝臟疾病患者中,外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的TIMP-1未發(fā)生明顯改變,而血清TIMP-1水平有助于肝臟纖維化的診斷。

[1]張連峰,田笑笑,王春峰.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1在肝纖維化診斷中的作用及關(guān)系[J].中華肝臟病雜志,2007,15(4):258.

[2]Fontana RJ,Goodman ZD,Dienstag JL,et al.Relationship of serum fibrosis markers with liver fibrosis stage and collagen content in patients with advanced chronic hepatitis C[J].Hepatology,2008,47(3):789.

[3]Iredale JP,Benyon RC,Arthur MJ,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 messenger RNA expression is enhanced relative to interstitial collagenase messenger RNA in experimental liver injury and fibrosis[J].Hepatology,1996,24(1):176.