酶法測定血清游離脂肪酸的方法學評價及臨床應用

李義龍,王 萌,唐志毅,韓靖云,黃桂玉

(衛生部北京醫院 檢驗科,北京100730)

游離脂肪酸(FFA)是由油酸、軟脂酸、亞油酸等組成,是甘油三酯的水解產物,大部分游離脂肪酸與血清白蛋白結合存在于血液中。血清中游離脂肪酸濃度受脂類代謝、糖代謝、內分泌功能等的影響。近年來研究發現FFA水平升高即可增加胰島素抵抗又可引起高胰島素血癥[1]。大多數肥胖人群的2型糖尿病患者都存在胰島素抵抗,而血漿游離脂肪酸(FFA)是聯系肥胖和胰島素抵抗或高胰島素血癥的重要環節[2]。目前測定血清FFA有滴定法,比色法,原子分光光度法,高壓液相層析法,氣相色譜法和酶法等。由于傳統方法操作繁瑣且精密度差,而日本積水醫療株式會社最新研制的酶法檢測血清FFA試劑盒具有特異性高精密度好,操作簡單并可直接用于自動生化儀檢測。本文將FFA酶法試劑盒進行方法學評價,并對部分2型糖尿病患者進行FFA檢測,結果如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集北京醫院臨床血清標本,按照FFA低、高2個水平制成混合血清,分裝后于-80℃儲存,用于不精密度測定;選擇FFA高值樣本用于線性分析。296例健康對照組:來自北京醫院健康體檢人員,男性164名,女性132名,用于參考范圍的建立。123例2型糖尿病組。

1.2 試劑與儀器 FFA酶法試劑盒、校準物、質控及干擾物均來自日本積水醫療株式會社。儀器為日本日立7170A型全自動生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 酶法FFA的不精密度試驗 參照美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)頒布的EP5-A文件方案[3]進行操作。收集低高值2水平FFA混合血清。連續測定20天,每天測定兩批,批間間隔的時間不少于2小時,每批對樣品做雙份測定,取均值,計算批內、批間、天間及總不精密度(cv%)。

1.3.2 酶法FFA的回收試驗 (1)基礎樣本:向0.9 ml低濃度FFA血清樣本中加入0.9%NaCl溶液0.1 ml;(2)回收樣本:向0.9 ml低濃度FFA血清樣本中分別加入濃度為 250、500、1 000 μ Eq/L 的FFA標準溶液各0.1 ml?；靹蚝笾貜蜋z測2次,計算均值。公式為:P=(X1-X0)/M×100%,其中P為回收率,X1為混合樣本的檢測平均值,X0為基礎標本濃度,M為添加的標準液濃度。

1.3.3 酶法FFA的干擾試驗 參考NCCLS EP7-A2[4]文件方案進行操作:在健康人混合血清中各自添加一定量的維生素C、膽紅素血紅蛋白、脂肪乳,同時測定這些標本的FFA濃度,每個濃度測定2份,結果取均值,以干擾程度為10%作為該系統對干擾物的最高限。

1.3.4 最低檢測限試驗 參照NCCLS EP17-A[5]評價方案,用1 ml蒸餾水為空白標本進行檢測,一次連續測定20次,對于離群的可疑值采用G檢驗方法進行驗證。

1.3.5 線性范圍測定 參照美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)頒布的EP6-A[6]評價方案,用高濃度血清和低濃度血清,配置20個濃度梯度的溶液進行檢測。每個濃度的標本同時測定2次,計算平均濃度。

1.3.6 參考范圍設置 參照NCCLS C28-A2[7]評價方案,男性164名,女性132名,均為健康群體。

1.4 統計學分析 統計學分析采用Microsoft Excel 2003,SPSS 11.0軟件?；貧w分析采用Passing-Bablok回歸,回歸線性檢測采用Cusum方法檢測,P＜0.05表示線性回歸偏倚有統計學意義。相關性分析采用Pearson相關,P＜0.05表示相關具有統計學意義。偏倚分析采用Bland-Altman方法。

2 結果

2.1 酶法FFA的不精密度試驗 檢測低值和高值分別為486及981 μ Eq/L 2種濃度FFA血清的批間、批內和總的CV見表1。CV的合格標準根據衛生部臨檢中心室間質量評估允許FFA誤差(25%)的1/4計算,因此CV應＜6.25%。根據表1可以看出批內 、批間、天間及總的CV 均 ＜6.25%,所以,酶法FFA試劑盒在檢測486至981 μ Eq/L濃度時精密度較好,總CV均小于5.0%。

2.2 酶法FFA試劑盒回收試驗 經計算3種不同濃度標準溶液的回收率分別為 98.0%、100.6%、103.7%,其回收率均在95%-105%范圍內,該方法的回收率良好。

表1 酶法測定FFA的不精密度

表2 酶法 FFA回收試驗(μ Eq/L)

2.3 酶法FFA的干擾試驗 較高濃度的維生素C、溶血素、膽紅素和乳糜對FFA測定值的干擾率均小于6%,即維生素C濃度＜500 mg/L、溶血素＜5 000 mg/L、膽紅素＜400 mg/L和乳糜＜2.0%對FFA測定值均無明顯干擾 。

2.4 最低檢測限試驗 測定FFA的最低檢測限為26.2 μ Eq/L 。

2.5 線性范圍測定 經測定結果顯示Y=1.028X+12.2,R2=0.999 6,P＜0.05;R2=0.999 6說明檢測值與理論值的相關性較好;b=1.028在0.97-1.03之間,說明斜率接近1;a=12.2說明截距接近0;P＜0.05說明所有偏移為抽樣誤差,因此當FFA濃度為35-1 780 μ Eq/L時線性良好,偏倚較小。

2.6 健康人群血清FFA參考范圍 男女兩組游離脂肪酸測定結果,分別經統計學處理,以±s表示,男性游離脂肪酸水平為:FFA 401.1±158.6 μ Eq/L;女性游離脂肪酸水平為:FFA 446.5±165.6 μ Eq/L,男女兩組游離脂肪酸水平比較無顯著性差異。統計分析后到出FFA的參考范圍為96-740 μ Eq/L,與廠家提供的參考范圍129-769 μ Eq/L基本一致。男性與女性比較P＞0.05無顯著性差異。

2.7 FFA在2型糖尿病中的應用價值 2型糖尿病(2 DM)患者及對照組的 GLU、FFA、TC、TG 、HDLC、LDL-C測定結果。2型糖尿病組GLU、FFA、TC、LDL和TG升高明顯,HDL降低,經統計學分析兩組間生化指標具有顯著性差異(P＜0.01)。2型糖尿病組中的GLU 與 FFA、TC、TG、HDL、LDL的相關系數分別為0.23,0.14,0.06,0.06,0.18。GLU和FFA的相關系數 r=0.23,顯著性水平為0.027,小于0.05,因此,GLU與FFA顯著相關。而與其它生化指標的顯著性水平均大于0.05,與GLU的相關性不顯著。由于在2型糖尿病組中的GLU與FFA具有顯著相關,FFA極有可能是反映胰島素抵抗的敏感指標。

3 討論

游離脂肪酸(FFA)代謝正常與否在2型糖尿病糖代謝異常的發生、發展中起了十分重要的作用[1]。2型糖尿病的另一主要發病機制是胰島β細胞分泌胰島素的缺陷。高水平的FFA可以直接損害胰島β細胞,最終發生與2型糖尿病相似的β細胞功能異常[8]。正確認識超重/肥胖患者胰島素抵抗和β細胞功能異常的不同階段中血清FFA水平的差異,有助于更好地理解FFA在疾病進展過程中所起作用?，F已發現大多數肥胖人群都存在胰島素抵抗,而血漿游離脂肪酸(FFA)是聯系肥胖和胰島素抵抗或高胰島素血癥的重要環節。肥胖的一個顯著病理學特征就是脂肪細胞和脂肪組織體積增大。糾正FFA代謝異常對肥胖和2型糖尿病的防治有十分重要的意義[9]。

本文參照NCCLS EP文件對日本積水醫療FFA試劑盒進行精密度、線性范圍、檢測限、干擾及回收試驗評估均取得良好的成績。FFA分別為486及981 μ Eq/L 2種濃度的總CV均小于5.0%,最低檢測限為26.2 μ Eq/L因此當FFA濃度為35-1 780 μ Eq/L時線性良好,偏倚較小。此試劑盒回收率較高均在95%-105%范圍內并具有較高的抗干擾能力,維生素C濃度＜500 mg/L、溶血素＜5 000 mg/L、膽紅素＜400 mg/L和乳糜＜2.0%對FFA測定值均無明顯干擾。對296名健康查體人群血清的FFA分布作了研究,結果顯示FFA的參考區間無性別差異參考區間為96-740 μ Eq/L。目前由于檢測血清FFA方法大多都不成熟,存在許多缺陷,其參考方法為高效液相質譜法,此方法需昂貴的儀器和復雜的操作,由于實驗室條件限制,故在方法學研究中未進行與其他方法比對,只是對FFA試劑盒的特性進行評價,包括不精密度、準確性、線性及抗干擾等可完全滿足臨床需要。本文對123例2型糖尿病人的部分血脂項目進行分析并與正常人作對照發現2型糖尿病人組的 GLU、FFA、TC、LDL-C和 TG升高明顯,HDL-C降低,經統計學分析兩組間生化指標具有顯著性差異(P＜0.01)。2型糖尿病組中的GLU與FFA、TC、TG、HDL、LDL的相關系數分別為 0.23,0.14,0.06,0.06,0.18。GLU和FFA的相關系數r=0.23,顯著性水平為0.027,P＜0.05,因此,GLU與FFA顯著相關。而與其它生化指標的顯著性水平均大于0.05,與GLU的相關性不顯著?？梢?型糖尿病組中的GLU與FFA具有顯著相關。另外,FFA測定一定要注意盡快分離血清并及時進行檢測,因血中含有各種脂肪酶存在,極易使TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA,使血中FFA值升高。貯存標本僅限于24 h內,若保存三天,其值約升高30%,血清于-80℃可保存3個月。

[1]Boden G,Chen X,Ruzi J,etal.mechanisms of fatty acids induced inhibition of glucose uptake[J].J Clin Endocrinol Metab,2001,86:2153.

[2]陳 江,姜東林,曹利民.β2型糖尿病患者血漿抵抗素和游離脂肪酸與胰島素抵抗關研究[J].中國微循環,2006,10(1):523.

[3]NCCLS.EP5-A2:Evalution of precision performance of quantitative measurement methods;approved guideline-second edition[S].Wayne PA,2004.

[4]NCCLS.EP7-A2:Interference testing in clinical chemistry;approved guideline-second edition[S].Wayne PA,2005.

[5]NCCLS.EP17-A:Protocols for determination of dimits of detection and dimits of duantization;Approved Guideline-Second Edition[S].Wayne PA,2004.

[6]NCCLS.EP6-A:Evalution of the linearity of quantitative measurement procedures:A statistical approach;Approved guideline[S].Wayne PA,2003.

[7]NCCLS.C28-A2:How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory[S].Wayne PA,2000.

[8]McGarry JD.Banding lecture 2001,Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes[J].Diabetes,2002,51(1):7.

[9]李義龍,張 延,王 萌.肥胖人群的血清游離脂肪酸水平調查[J].中國實驗診斷學2008,5(12):652.