優化培養基對桑黃菌絲體生長的影響

鐘 石，李有貴，朱儉勛，林天寶，呂志強，葉偉清

(1.浙江省農業科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021;2.桐廬縣農技推廣中心 蠶桑站，浙江 桐廬 311500)

桑黃 (Phellinus igniarius)學名鮑氏層孔菌，屬擔子菌亞門，層菌綱，多孔菌目，多孔菌科，針層孔菌類真菌，俗稱桑臣、桑黃菇等，是寄生于桑樹等闊葉樹的一種藥用真菌，因為具有獨特的抗癌等功效，已引起國內外醫藥界與保健品行業的關注［1-3］。近年來，日本、韓國相繼對其進行開發，主要應用于肝炎及癌癥的治療，療效顯著。據有關資料顯示，桑黃對腫瘤抑制率高達96.78%，是目前國際公認的生物抗癌領域中有效率最佳的藥用真菌［4-8］。

由于國內外市場對桑黃的需求量越來越大，致使國內各產地藥農掠奪性采集，子實體孢子無法大量形成，野生桑黃面臨枯竭。采用液體深層培養技術大規模生產桑黃菌絲體是滿足國內外市場需要的有效途徑。為此我們探討了桑黃菌液體發酵的適宜培養基，以便為進一步研究液體發酵工藝及提取桑黃有效成分提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

桑黃 (Phellinus igniarius(L.ex Fr.)Quel)，由本試驗室從浙江桐廬桑園桑樹上寄生的野生桑黃子實體中分離。

1.1.2 試劑

乳糖、葡萄糖、蔗糖、KH2PO4、MgSO4等均為國產分析純，玉米粉、酵母粉、麥胚等提取液均為煮沸20 min后用濾布過濾制得。

1.1.3 儀器

華利達HZ-9610K冷凍振蕩培養箱，Christ ALPHA 1-2LD冷凍干燥機，Mettler Toledo AL204電子天平。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養

母種選用PDA培養基;液體母種培養基為:20%馬鈴薯，2%白砂糖，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4。

液體菌種培養條件:液體母種用均質機1000 r·min-1勻漿處理1 min用于接種，50mL三角瓶中裝液體菌種培養基 20mL，25℃，120 r·min-1振蕩培養8 d。

1.2.2 氮源篩選

2% 白 砂 糖，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4，pH值自然，分別以蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米粉、酵母浸出粉、麥胚粉、土豆粉為氮源，添加量 20 g·L-1。

1.2.3 碳源篩選

20%馬鈴薯，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4，pH值自然，分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、白砂糖、紅糖為碳源，添加量20 g·L-1。

1.2.4 無機鹽篩選

20%馬鈴薯，2%白砂糖，pH值自然，以KH2PO4、MgSO4、K2HPO4、CaCl2、 (NH4)3C6H5O7(檸檬酸三銨)為無機鹽篩選對象，添加量為1.0 g·L-1。

1.2.5 培養基優化

以麥芽糖、酵母粉為碳、氮源，添加KH2PO4、MgSO4、檸檬酸三銨、復合維生素B，設計L18(36)6因素3水平正交試驗 (表1)，優化培養基配方。

表1 L18(36)正交試驗的因素與水平

1.2.6 添加桑枝提取物

在優化的培養基中分別添加桑枝提取物，添加量分別為 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%和0.8%。

1.3 測定方法

發酵液8000 r·min-1離心后收集菌絲體，用水清洗3次，冷凍干燥后稱重。

2 結果與分析

2.1 培養基配方

由圖1可知，不同碳源培養基培養的桑黃菌絲體生物量由大到小順序依次為:麥芽糖＞葡萄糖＞紅糖＞蔗糖＞白砂糖。

圖1 碳源對桑黃菌絲體干物重的影響

不同氮源的菌絲體生長也有明顯差異，以酵母粉作氮源，產量最高，達14.37 g·L-1，其次分別為酵母膏和麥胚粉，以土豆作氮源的產量最低 (圖2)。

添加不同無機鹽對桑黃菌絲體干物重影響較大，其中檸檬酸三銨效果較為明顯 (圖3)。

考慮到鎂鹽和磷酸鹽對普通微生物發酵的重要性，選取檸檬酸三銨、KH2PO4、MgSO4作礦質元素添加。同時在培養基中添加微量復合維生素B有利于桑黃生物量的增加，隨著用量的增加，菌絲體干物重反而逐漸減小 (圖4)。

圖2 氮源對桑黃菌絲體干物重的影響

圖3 無機鹽對桑黃菌絲體干物重的影響

圖4 復合維生素B對桑黃菌絲體干物重的影響

2.2 培養基優化

由表2的L18(36)試驗因素及水平分析可知，菌絲體生物量的最優培養基配方組合為A3B2C3D1E3F1，菌絲體生物量為 20.23 g·L-1，確定桑黃的液體深層發酵培養基配方為:麥芽糖30 g·L-1，酵 母 粉 20 g · L-1，MgSO41.5 g·L-1，KH2PO41.0 g·L-1，檸檬酸三銨 1.0 g·L-1，復合維生素B 0.01%。

表2 各處理組合對菌絲體干物重的影響

2.3 添加桑枝提取物

添加不同濃度的桑枝提取物對桑黃生物量的影響有一定的差異 (圖5)，在一定范圍內，隨著桑枝水提物添加量的增加，菌絲體干物重也隨之增加，當在培養基中加入0.3%桑枝水提物時，菌絲體干物量則達24.48 g·L-1，之后則隨著添加量的增加，菌絲發生自溶現象，生物量也隨之逐漸降低。

圖5 添加桑枝提取物對桑黃菌絲體干物重的影響

3 小結與討論

在我國，桑黃入藥已有2000多年的歷史，最早記載始于 《本草綱目》。由于桑黃生長需要較為特殊的自然氣候環境，生長期長，因而天然桑黃數量非常稀少，因此采用液體深層培養技術大規模生產桑黃菌絲體將是一個有效途徑。

以菌絲體干物重為基礎，對野生桑黃菌絲體液體發酵的培養基營養元素 (氮源、碳源、礦物元素、復合維生素B)進行篩選，獲得優化的菌絲體液體配方:3%麥芽糖，2%酵母粉，0.15%MgSO4，0.10%KH2PO4，0.10% 檸 檬 酸 三 銨，0.3%桑枝水提物，0.01%復合維生素B。

考慮寄生于桑樹之上的桑黃為其中正品，因此我們在優化了高效生產桑黃菌絲體液體發酵培養基的基礎上，在培養基中引入桑枝提取物，結果發現桑枝提取物不僅對桑黃菌絲體生長具有一定的促進作用，而且相對于對照組，添加桑枝提取物后，菌絲體顏色較深，不容易退化成白色，這可能是因為桑枝提取物中的某些物質可以在一定程度上延緩菌種退化的時間，至于兩者之間的藥效是否存在差異還有待于進一步研究。

［1］卯曉嵐.中國大型真菌 ［M］.鄭州:河南科技出版社，2000，465-468，477.

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［4］張敏，紀曉光，貝祝春，等.桑黃多糖抗腫瘤作用 ［J］.中藥藥理與臨床，2006，22(3):58-60.

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