黃連、大黃和苦參聯合應用對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性研究

任書青 楊繼章 王長友

金黃色葡萄球菌(MRSA)是社區、醫院中內源和外源性感染的主要病原菌，它致病性廣，耐藥性產生快;甲氧西林自1959年開始用于治療耐青霉素的葡萄球菌感染，1961年就產生了耐甲氧西林的MRSA。近年MRSA的陽性率迅速上升，其多重耐藥譜也不斷擴大，再加上其耐藥性傳遞及多重耐藥譜迅速擴大的機制至今還未闡明，MRSA已成為了世界性難題。MRSA對氨芐西林、四環素、利福平、亞胺培南、環丙沙星、慶大霉素、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢唑林的耐藥率均大于90.0%，對紅霉素、克林霉素和克拉霉素的耐藥率逐年下降;還未發現耐萬古霉素的MRSA［1］。因此，探討新的抗MRSA感染的藥物，已迫在眉睫。中草藥與西藥配伍尚能逆轉西藥的耐藥性［3］，因此，探討中西藥的配伍也具有廣闊的前景。

1 材料與方法

1.1 試藥 黃連(產地:四川)、大黃(產地:甘肅)、苦參(產地:內蒙古)由河北醫科大學第一醫院主管中藥師張一民鑒定為真品。MRSA菌種(臨床標本分離菌株，由河北醫科大學第一醫院臨床檢驗中心提供)。ATCC25923標準金黃色葡萄球菌株(標準菌株，河北耐藥監測中心提供)。MH培養基(北京三藥科技開發公司);MH肉湯(北京陸橋技術有限責任公司)。

1.2 儀器 TDR-200B型自動微生物鑒定系統(湖南長沙天地人生物科技有限公司);DL-CJ-1F實驗醫用型潔凈工作臺(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司北京分公司);DH3600AB型電熱恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司);一次性使用培養板(姜堰市天力醫療器械有限公司，批號:20090218)。一次性痰杯(姜堰市瑞康醫療器械有限公司，批號:20090118)。

1.3 方法

1.3.1 藥液的準備:取黃連、大黃和苦參，各3份，每份50 g，單獨和兩兩等比例混合后加適量的水浸泡30 min，然后用水煎煮，第1次1.0 h，第2、3次各0.5 h。合并3次濾液，加熱濃縮使原藥液濃度為1 g/ml;沸水浴滅菌45 min;再將黃連、大黃、黃連和大黃配伍液、黃連和苦參配伍液稀釋到100 mg/ml，備用。

1.3.2 藥液的配制:采用二倍稀釋法:取含8排12孔的一次性使用培養板，分別標記，在標號1～12孔中各加入MH肉湯培養液100 μl，在每排的第1孔各加入原藥液(100 mg/ml)100 μl，將第1孔混勻后，抽取100 μl加入第2孔，將第2孔混勻后再抽取100 μl加入第3孔，依次倍比稀釋至第10孔，將第10孔混勻后抽取100 μl棄取，第11孔為陰性對照，第12孔為陽性對照。1 ～10 孔中藥液濃度依次為:50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.57、0.79、0.39、0.20、0.10 mg/ml。其中苦參及大黃和苦參的藥液濃度 1 ～10 孔依次為:500.00、250.00、125.00、62.50、31.30、15.70、7.90、3.90、2.00、1.00 mg/ml。

1.3.3 菌種的制備:用接種環挑取MRSA菌落，接種于MH肉湯培養基中，置37℃培養24 h，用接種環挑取較大菌落2～3個，移至2 ml滅菌注射用水中，待檢前調節菌液濃度至0.5麥氏比濁管濁度。用 MH肉湯培養液1∶10稀釋(含菌量為107cfu/ml)，供測定MIC用。

1.3.4 接種:用微量加樣器取100 μl MRSA菌液，依次加入各孔中(第11孔除外)，37℃恒溫培養24 h，觀察細菌生長情況，培養液澄清的為陰性(即無細菌生長)，培養液混濁的為陽性(即有細菌生長)。以此確定藥液的MIC，MIC50，MIC90值。

2 結果

2.1 黃連、大黃、苦參單藥及兩兩配伍后對MRSA的 MIC，MIC50，MIC90值 見表1。

2.2 FIC指數計算 FIC指數=A藥聯合時MIC/A藥單用時MIC+B藥聯合時MIC/B藥單用時MIC。當FIC指數≤0.5時，為協同作用;當1≥FIC指數＞0.5時，為相加作用;當2≥FIC指數＞1時，藥物體外的相互作用方式為無關;當FIC指數＞2時，為拮抗作用。

表1 黃連、大黃、苦參及其相互配伍后對MRSA 的 MIC、MIC50、MIC90 值 mg/ml

對MIC90其FIC指數如下:(1)黃連-大黃FIC指數=4.21，FIC 指數 ＞2，為拮抗作用;(2)黃連-苦參 FIC 指數 =1.01，2≥FIC指數＞1，藥物體外的相互作用方式為無關;(3)大黃-苦參 FIC 指數 =0.69，1≥FIC 指數 ＞0.5時，為相加作用。

對MIC50 FIC指數如下:(1)黃連-大黃FIC指數 =4.28，FIC指數 ＞2，為拮抗作用;(2)黃連-苦參 FIC指數 =1.01，2≥FIC指數＞1，藥物體外的相互作用方式為無關;(3)大黃-苦參FIC 指數 =0.69，1≥FIC 指數 ＞0.5時，為相加作用。

3 討論

中草藥與抗生素相比具有以下優點［3］:(1)具備非特異性抗菌作用并能調節及提高機體免疫力;(2)不良反應小，在體內藥物殘留量低;(3)細菌較少對中藥產生耐藥。因此，研究探索抗MRSA的中草藥前景廣闊。

黃連具有良好的抗菌作用，而且與多種中草藥配伍呈現出協同作用，在臨床應用廣泛，是一種具有廣闊前景的中草藥［4，5］。但由于黃連中含有大量生物堿，當與大多數中草藥配伍時，易產生沉淀，從而影響其藥效的發揮。因此，對含有黃連的復方制劑的提取，應從工藝上進行改進，以減少沉淀的產生，充分發揮黃連的療效。

本研究顯示，無論對MIC50而言，還是對MIC90而言，黃連與大黃配伍均呈現出拮抗作用，黃連和苦參配伍呈現無關作用，只有大黃和苦參配伍方呈現出相加作用。

本課題旨在探討中草藥聯合應用對MRSA感染的治療作用，從本次試驗數據來看，大黃和苦參配伍呈現相加作用，黃連與大黃配伍呈現拮抗作用，黃連和苦參配伍呈現無關作用，但這僅代表體外作用的結果，至于體內作用如何，有待進一步的研究。本文采用水煎劑型，與臨床常用的服藥劑型相同，結果具有可借鑒性。

1 郭靚，范紅，陳知行，等.華西醫院5年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌醫院感染調查.中華醫院感染學雜志，2009，19:1151-1154.

2 曾春蘭，鐘振國.中藥抗菌作用的研究進展.廣西中醫學院學報，2006，9:51-53.

3 陳勇川，謝林利，熊麗蓉，等.黃芩苷/黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性的逆轉作用研究.中國藥房，2008，19:644-645.

4 徐帆，李平，楚更五，等.3種中藥提取物對幽門螺桿菌的體外聯合抗菌效應研究.中國藥房，2007，18:2573-2574.

5 任書青，曹德英，楊繼章，等.五倍子、黃芩和黃連聯合應用對MRSA的體外抗菌活性研究.中國藥房，2010，21:198-199.