吡格列酮拮抗鏈脲佐菌素誘導培養皮層神經元損傷的保護作用1)

馬國英,楊小榮,趙 欣,趙晉楓,秦華平,史瑞紅,張 策

研究發現糖代謝障礙不僅存在于糖尿病而且也存在于阿爾茨海默病(AD)[1],進一步的研究證實糖尿病和AD有共同的病理改變,如糖尿病患者AD的發生率明顯高于同齡的非糖尿病者,制作糖尿病的工具藥鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射和腦室注射均可引起神經損傷及AD樣的病理變化,腦內也發現有Aβ的沉積和Tau蛋白的過度磷酸化等AD樣的病理特征。而AD大多數伴有糖代謝的紊亂。腦室注射STZ可以導致正常大鼠出現AD樣的病理變化,如線粒體功能異常、神經元死亡、學習記憶與認知障礙等。在離體神經細胞培養中可以引起細胞活力下降,活細胞數目減少,乳酸脫氫酶(LDH)釋放增加。其機制可能是削弱或破壞胰島素信號轉導,破壞胰島素受體自身磷酸化和內在酪氨酸激酶活性,增加磷酸化酪氨酸磷酸酶的活性[2],導致胰島素信號轉導障礙,引起腦葡萄糖代謝紊亂和能量生成受阻。

吡格列酮(Pioglitazone)屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑,主要通過結合和活化過氧化物酶體增殖物激活的受體γ(PPARs)而增強細胞對胰島素作用的敏感性,在臨床上主要用于2型糖尿病的治療。已證實吡格列酮對側腦室注射STZ的大鼠的空間記憶力和海馬的突觸結構和神經元的受損有保護作用[3]。而同樣屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑的羅格列酮對散發性老年癡呆大鼠學習記憶功能有明顯的改善作用[4]。噻唑烷二酮類胰島素增敏劑可能對AD有預防治療作用[5]。吡格列酮對由STZ引起的神經損傷有保護作用。前期實驗證實STZ對離體培養的神經細胞也具有損傷作用,那么吡格列酮對離體培養的神經細胞STZ損傷是否也有保護作用?

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 新生1 d～3 d Wistar大鼠(山西醫科大學動物管理中心)。STZ、Calcein-AM 購于 Sigma公司,吡格列酮由浙江華義醫藥有限公司惠贈,DMEM購于Gibico,胎牛血清(FBS)購于杭州四季青公司。將STZ溶于D-Hanks溶液中,配成10 mmol/L的母液,由于STZ溶液的半衰期在生理pH值條件下為19 min[6],需要溶解后立即使用。吡格列酮用二甲亞砜(DMSO)溶解,再用DMSO溶液稀釋配置成0.1 mmol/L,1 mmol/L,10 mmol/L的母液,常溫保存,培養液中DMSO終濃度不得高于0.1%。

1.2 實驗分組 神經細胞培養到第7天時,將培養的神經細胞隨即分組:由于中樞的胰島素主要來自兩方面,由胰島產生即外周血漿中的胰島素透過血腦屏障進入中樞和神經組織自身合成的胰島素[6],為了更好模擬在體情況,在實驗中都加入胰島素15μU/mL。對照組以全配液培養;STZ組,在全配液培養;吡格列酮組,在全配液中加入終濃度(0.01 μ mol/L,0.1 μ mol/L,1 μ mol/L)的吡格列酮,24 h后除了對照組以外其他組都加STZ(100μ mol/L)。共同作用36 h后觀察細胞的活力以及活細胞數目(LDH,CCK-8和Calcein-AM染色)。

1.3 原代皮層神經細胞培養 取新生1 d～3 d的Wistar大鼠,將大腦皮層神經細胞分離成單細胞懸液,按細胞濃度為1×106接種于預先用多聚賴氨酸包被的培養皿或96孔板中,放在37℃,5%CO2培養箱中培養。24h后加入阿糖胞苷(10μ mol/L)抑制膠質細胞生長。

1.4 細胞活力分析 在96孔板中培養的皮層神經細胞經提前24 h加入吡格列酮,再經STZ誘導36 h后,還新的全配液,每空加入10 μL的 CCK-8,37℃避光培養 2 h,到酶標儀上測定450 nm吸光度值。

1.5 LDH釋放的檢測 將皮層神經細胞培養在培養皿中,經提前24 h加入吡格列酮,再加入STZ誘導36 h后,收集細胞培養液進行LDH活性的檢測。

1.6 Calcein-AM染色 將皮層神經細胞培養在有玻片的培養皿中,經提前24 h加入吡格列酮,再加入STZ誘導36 h后,用PBS液沖洗3次,加入終濃度為10μ mol/L的Calcein-AM,37℃避光培養 20 min,再經 PBS避光洗滌 3次后,在激光共聚焦顯微鏡(Olympus,FV-1000)下觀察細胞,激發波長為490 nm,發射波長為515 nm拍片。

1.7 統計學處理 測定結果由統計軟件SPSS 13.0進行分析,用均數±標準差(±s)表示,進行單因素方差分析,檢驗水準取α=0.05,P＜0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1 CCK-8的測定 STZ組與對照組比較,細胞活力明顯下降,STZ組由對照組的100%降至63.93%(P＜0.01);提前24 h加入吡格列酮(0.01 μ mol/L)細胞活力升高12.83%(P＜0.01,n=4);吡格列酮(0.1 μ mol/L)細胞活力升高 6.06%(P＜0.05);吡格列酮不能抑制STZ引起的細胞活力下降。詳見圖1。

圖1 吡格列酮對STZ誘導皮層神經細胞損傷的保護作用(CCK-8檢測)

2.2 Calcein-AM染色 STZ處理后,活細胞的數量明顯減少,伴有突起數目明顯減少;提前加入吡格列酮明顯抑制STZ引起的活細胞數目減少,突起數目明顯增加;吡格列酮抑制STZ引起的活細胞數目減少,突起數目增加;吡格列酮不能抑制STZ引起的活細胞數目減少。

2.3 LDH釋放的檢測 STZ組與對照組比較,LDH的含量明顯增加,釋放量增加42.31%(P＜0.01);吡格列酮(0.01μ mol/L)可以降低有STZ引起的細胞損傷,使 LDH的釋放減少14.46%(P＜0.01);吡格列酮(0.1 μ mol/L)可以降低STZ引起的細胞損傷,使LDH的釋放減少10.04%(P＜0.05);吡格列酮(1 μ mol/L)不能抑制STZ引起細胞 LDH的釋放。詳見圖2。

圖2 吡格列酮對STZ誘導皮層神經細胞損傷的保護作用(LDH釋放水平檢測)

3 討 論

中樞胰島素主要由胰島產生即外周血漿中的胰島素透過血腦屏障進入中樞,然而研究發現神經組織自身也可以合成胰島素并參與代謝調節而發揮作用[7]。胰島素受體在腦內皮層、海馬等與認知功能密切相關的區域分布較密集。胰島素通過它與細胞膜上的胰島素受體(IR)相結合,通過胰島素信號轉導過程激發細胞內特定的生理生化反應[8]。

研究證實,糖代謝紊亂和AD發病機制有密切的聯系,尤其在晚發性AD中,糖代謝紊亂可能是重要的始動因子。多種證據顯示腦內糖代謝障礙可以引起認知功能受損,而認知功能障礙為主的AD常伴有腦內糖代謝障礙。由于糖代謝紊亂(糖尿病)與AD間有著非常密切的聯系,有可能存在同樣的發病因素和病理過程,因而有專家提出AD可能是一種大腦特異的神經內分泌疾病或者稱“3型糖尿病”[9]。

吡格列酮是一種作用于PPAR-γ的胰島素增敏劑,PPAR-γ被激活后提高胰島素敏感性,通過胰島素受體和受體后途徑,加強胰島素信號系統作用,增加靶細胞中胰島素受體的表達;增加胰島素受體底物(IRS)的表達,促其磷酸化;增加靶細胞中PI-3K調節亞基的表達,促進胰島素功能實現。吡格列酮也可能通過增加胰島素受體酪氨酸激酶活性,起到保護作用。吡格列酮對側腦室注射STZ大鼠空間記憶力和海馬突觸結構和神經元的受損有保護作用[1]。而同樣屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑的羅格列酮對散發性老年癡呆大鼠學習記憶功能有明顯的改善作用[2]。

本實驗應用離體神經細胞培養的方法證實一定濃度的吡格列酮(0.01 μ mol/L和 0.1 μ mol/L)可拮抗STZ對培養的神經細胞產生的毒性作用,包括細胞活力的逐漸增加,LDH的釋放逐漸增少,以及活細胞數目的逐漸增加。本實驗結果為吡格列酮的神經保護作用提供了新的證據,即除已經證實的吡格列酮對側腦室注射STZ引起的大鼠神經系統損傷有保護作用以外,在離體情況下,吡格列酮同樣可以起到保護作用。但本實驗所觀察到的低濃度吡格列酮(0.01 μ mol/L和0.1 μ mol/L)可以發揮保護作用,而較高濃度吡格列酮(1 μ mol/L)不能抑制發揮保護作用,其詳細機制不明,有待進一步研究。

[1]Lester CN,Rivera EJ,Soscia SJ,et al.Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes:Relevance to sporadic Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis,2006,9:13.

[2]Steen E,T erry BM,Rivera EJ,et al.Impaired insulin and insulinlike growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer's disease is this type 3 diabetes[J].J Alzheimers Dis,2005,7:63-80.

[3]付鵬程,楊期東.吡格列酮對癡呆大鼠模型空間記憶及海馬結構的影響[J].中國現代醫學雜志,2009,19(9):1294-1297.

[4]張玉,歐陽昌漢,吳基良,等.羅格列酮對散發性老年癡呆模型大鼠認知功能的影響[J].咸寧學院學報,2008,22(2):96-99.

[5]Delamonte SM,Tong M,Lester-coll N,et al.Therapeutic rescue of neurodegeneration in experimental type 3 diabetes:Relevance to Alzheimer's disease[J].J Alzheimer's Dis,2006,10(1):89-109.

[6]Muller D,Nitsch RM,Wurtman RJ,et al.Streptozotocin increases free fatty acids and decreases phospholipids in rat brain[J].J Neural Transm,1998,105:1271-1281.

[7]Rivera EJ,Goldin A,Fulmer N,et al.Insulin and insulin-like growth factor expression and function deteriorate with progression of Alzheimer's disease:Link to brain reductions in acetylcholine[J].J Alzheimers Dis,2005,8(3):247-268.

[8]CoBB HM,Rose MO.T he insulin receptor and tyrosine protein kinase activity[J].Biochimicaet Biophysica Acta,1984,738(1-2):1-8.

[9]Sun M K,Alkon DL.Links between Alzheimer's disease and diabetes[J].Drugs Today(Barc),2006,42:481.