依達拉奉干預對大鼠腦出血模型細胞凋亡相關通路的影響

韓 寧 丁素菊 吳丹紅

腦出血后存在神經細胞凋亡已經為許多研究所證實。Qureshi等發現ICH患者發病后24 h內的血腫周圍組織中即可檢測到凋亡細胞，5d時仍存在凋亡現象［1］。Xue等在大鼠自體動脈血ICH模型的研究中發現，術后4 h即開始出現細胞凋亡，并可持續4周［2］。另有研究發現，自由基與細胞凋亡有著密切的關系，腦出血后由于周圍組織缺血、紅細胞破裂、鐵離子釋放及炎癥反應等，促使自由基大量生成，而自由基可以通過損傷DNA、影響信號傳導以及參與表達調控等介導細胞凋亡。我們前期研究發現大鼠腦出血模型中自由基和細胞凋亡呈正相關［3］。

目前研究認為細胞凋亡途徑主要有三條，包括線粒體途徑、死亡受體途徑（TNF受體途徑）及內質網途徑。已有大量研究證實，線粒體途徑和神經系統凋亡密切相關，腦出血后Cyto C釋放是神經細胞凋亡的一個關鍵事件［4］。對于內質網途徑和死亡受體途徑在腦出血后細胞凋亡中的作用及其與自由基的相關性目前研究較少。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠，體重300g左右，購于中科院。多克隆的兔抗Caspase－3抗體、FITC標記的綿羊抗兔IgG抗體、DAB染色試劑盒購自武漢博士德公司，多克隆兔抗TNF－α抗體、抗體稀釋凍干粉、多克隆兔抗Caspase－8抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，HRP－抗兔Ig G抗、tween－20、Hoechst染色試劑盒購自碧云天生物技術研究所，Triton－100購自AppliChem公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立參照 Deinsberger［5］、周中和等［6］報道方法，采用二次注血／退針法制備大鼠ICH模型，大鼠稱重后給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.4 g／kg）；大鼠麻醉后俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀［7］上，門齒溝水平比耳間線低2.6 mm；常規備皮消毒、切開，選擇注射點為尾殼核，將微量注射儀尖端定位于前囟前0.5 mm，中線旁開3 mm，垂直進針6 mm，用微型手鉆在此鉆一直徑0.5 mm的小孔；用1 ml注射器取大鼠自體股靜脈不凝血80μl，沿所鉆小孔進針6 mm（相當于大鼠尾殼核部位），先注入20μl，停針2 min后繼續緩慢注入60μl（2 min內均勻注入）后，留針約2 min，退針2 mm，再停針約2 min，緩慢將注射器完全退出。假手術組為只進針到尾殼核后不注血，停針6 min后退針。骨蠟封閉顱骨創口，縫合頭皮及大腿內側皮膚，局部皮膚用碘汀消毒，置于溫暖環境中直至清醒。

1.2.2 模型成功判斷

大鼠蘇醒后參照Bederson［8］法進行神經功能缺陷評分，即0分：前爪伸直，無神經功能缺損；1分：腦部病變對側腕關節、肘關節屈曲，肩內收屈曲；將尾巴提起，癱瘓側前肢回收屈曲于腹下（正常側前肢向地面伸展）；2分：上述體征＋向麻痹側推阻力下降；3分：活動時向麻痹側打圈（呈追尾狀）。評分≥2分者入選。

1.2.3 分組

將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、依達拉奉干預組（1 mg／kg、3 mg／kg）。模型組和兩種劑量的干預組又各自分為6、12、24、48、72 h、7、14 d七個亞組。假手術組（n＝6），模型組和依達拉奉干預組（兩個劑量）每一亞組（n＝6）。

依達拉奉干預組于造模成功后1 h給予依達拉奉腹腔注射（3 mg／kg組以藥物原液注射，1 mg／kg將原液稀釋為相同容量后注射），1次／24 h，分別于6、12、24、48、72 h、7、14 d七個時間點處死。

假手術組及模型組造模完畢后，以等量生理鹽水腹腔注射。假手術組于造模后24 h處死；模型組分別于造模后相應時間點處死大鼠并取材。

1.2.4 TNF－α免疫組織化學染色 各組相應時間點處死后，使用免疫組織化學染色的卵白素－生物素復 合 物 法 （avidin－biotin comeplex，ABC）制 作TNF－α的免疫染色。用10μl磷酸鹽緩沖溶液代替一抗（抗TNF－α抗體）作為陰性對照。陽性對照為已知商品化的陽性片。TNF－α定位于細胞漿，光鏡下以細胞核周邊呈棕黃色或褐色為TNF－α陽性染色。利用圖像管理系統在200倍視野下隨機選擇5個不重復視野，輸入Image－Pro Plus圖像處理軟件分析系統，記取平均灰度值。

1.2.5 凋亡相關蛋白的免疫印跡檢測 提取總蛋白，應用BCA試劑盒定量，SDS－PAGE凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜，于水平搖床室溫封閉1 h，4℃一抗孵育過夜（封閉液配一抗，此處一抗為兔抗的Caspase－3抗體1∶100／兔抗 Caspase－8抗體1∶200），室溫二抗孵育2 h（二抗為HRP－抗兔IgG抗體），ECL系統顯色。

1.2.6 統計學處理 數據以均數±標準差表示，采用SPSS11.0統計軟件。多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗。以P＜0.05為有統計學差異。

2 結 果

2.1 TNF－α在腦組織含量

假手術組于針道周圍可見少量TNF－α陽性表達細胞，24 h時表達量最高，7、14d未見陽性表達。模型組和藥物干預組均于6 h即可觀察到TNF－α陽性細胞，主要位于血腫周圍及同側皮質，從形態觀察以星形膠質細胞和小膠質細胞居多，也可見神經元陽性表達；12、24 h陽性細胞數持續增加；3 d時達到高峰，范圍也明顯擴大，于血腫周邊細胞、雙側皮質、海馬均可見TNF－α陽性細胞；7 d時模型組陽性表達明顯減少，藥物干預組陽性表達消失；14 d時模型組、藥物干預組均未見陽性表達（表1、圖1、2）。

表1 不同時間點各組大鼠TNF－α表達量的變化（±s，平均灰度值）

表1 不同時間點各組大鼠TNF－α表達量的變化（±s，平均灰度值）

注：與模型組比較，△P＜0.01

組別TNF－α表達量6 h 12 h 24 h 2 d 3 d 7 d 14 d無表達 無表達模型組 34.26＋4.37 44.56＋9.35 51.32＋10.32 56.24＋11.35 68.56＋12.64 18.37＋5.79 無表達依達拉奉干預組 10.42＋2.35△ 18.23＋4.97△ 20.35＋6.38△ 30.72＋11.46△ 35.81＋12.57△ 無表達△假手術組 1.32＋0.54 3.32＋1.24 5.56＋1.05 5.04＋1.72 1＋0.32無表達

圖1 免疫組化檢測TNF－α在腦組織中的表達水平

圖2 不同時間點各組大鼠TNF－α含量的變化，與依達拉奉干預組比較，＃P＜0.01

2.2 Caspase－3免疫熒光

假手術組針道周圍細胞核數量略減少，可見少量Hoechst濃染細胞，Caspase－3表達較手術對側略增加。模型組和兩種劑量的藥物干預組均于6 h即可觀察到Hoechst濃染細胞，24 h明顯增加，72 h達高峰，之后逐漸減少，14 d時于血腫周圍仍可見少量Hoechst濃染細胞，各個時間點模型組均較3 mg／kg藥物干預組濃染細胞量大。模型組和兩種劑量的藥物干預組6 h即可觀察到Caspase－3陽性表達，表達高峰為24 h，模型組陽性表達量均較3 mg／kg藥物干預組明顯增高（圖3）。

2.3 Caspase－3的 Western blot檢測

假手術組選擇72h，其余各組選擇6、72 h兩個時間進行Caspase－3的 Western blot檢測。Full Caspase－3表示未經切割的無活性酶原，分子量為35k D，Cleaved Caspase－3為切割后的活性酶，切割后分子量為17k D。半定量檢測發現假手術組72 h未見Caspase－3激活；模型組及兩種藥物干預組均于6 h即出現Caspase－3激活，72 h量明顯增加；兩個時間點激活后的Caspase－3表達量：模型組＞藥物干預組（1 mg／kg）＞藥物干預組（3 mg／kg）（圖4）。

圖3 免疫熒光檢測Caspase－3在腦組織中的表達水平

圖4 Western blot檢測腦組織中Caspase－3的激活 1、2為藥物干預組（3 mg／kg）72、6 h；3、4為藥物干預組（1 mg／kg）72、6 h；5、6為模型組72、6 h；7為假手術組72 h

2.4 血腫周邊腦組織caspase－8的表達及激活 假手術組選擇72 h，其余各組選擇24、72 h兩個時間進 行 Caspase－8 的 Western blot 檢 測。Full Caspase－8表示未經切割的無活性酶原，分子量為57 k D，Cleaved Caspase－8為切割后的活性酶，分子量為45 k D。半定量檢測發現假手術組72 h未見Caspase－8激活；模型組及兩種藥物干預組于24 h可見Caspase－8激活，72 h量明顯增加；兩個時間點激活后的Caspase－8表達量：模型組＞依達拉奉組1（1 mg／kg）＞依達拉奉組2（3 mg／kg）（圖5）。

圖5 Western blot檢測腦組織中Caspase－8的激活 1、2為藥物干預組（3 mg／kg）72、24 h；3、4為藥物干預組（1 mg／kg）72、24 h；5、6為模型組72、24 h；7為假手術組72 h

3 討 論

通常情況下腫瘤壞死因子－α（TNF－α）是由單核細胞或巨噬細胞產生，是繼即早基因（Immediate early gene，IEG）表達后首個增高的前炎癥因子，具有多種生物學效應。有研究證實腦出血后TNF－α表達及分泌水平明顯升高［9］，在出血后48 h達到高峰［10］，TNF－α 表 達 量 增 加 與 凝 血 酶 有 密 切 的 關系［9］。項潔等發現TNF－α表達量與細胞凋亡呈正相關［11］，認為 TNF－α的表達也是細胞凋亡觸發機制之一。本實驗發現腦出血后6 h既有TNF－α的表達和分泌，72 h時表達量最高，7 d時模型組明顯減少，藥物干預組表達消失；14 d時模型組和藥物干預組均未觀察到TNF－α陽性表達。

大量研究證實，TNF－α可以通過激活死亡受體Fas／APO－1誘導細胞凋亡，Fas屬于 TNFR／NGFR家族成員，是Ⅰ型跨膜受體蛋白，分布于胸腺細胞、激活的T和B淋巴細胞、巨噬細胞、肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細胞等。Fas具有三個富含半胱氨酸的胞外區和一個稱為死亡結構域的胞內區。TNF－α與Fas結合后Fas三聚化使胞內的DD區構象改變，然后與接頭蛋白FADD的DD區結合，而后FADD的N端DED區就能與Caspase－8（或－10）前體蛋白結合，形成 DISC，引起caspase－8、10通過自身剪激活，它們啟動caspase的級聯反應，使caspase－3、－6、－7激活，這幾種 Caspase可降解胞內結構蛋白和功能蛋白，最終導致細胞凋亡。

本實驗發現腦出血后在TNF－α表達增高的同時，Caspase－8和Caspase－3也出現表達量的增加，通過Western blot檢測發現模型組和藥物干預組均于6h即出現Caspase－3表達量增加和激活，72h表達量高于6h；兩個時間點激活型和非激活型Caspase－3表達量模型組均高于藥物干預組。模型組和藥物干預組于24h可檢測到激活型的Caspase－8，72h表達量明顯增加；兩個時間點激活型的Caspase－8表達量模型組均大于藥物干預組。Caspase－8激活時程和TNF－α表達時程相一致，但晚于Caspase－3的激活，說明除了TNF通路以外，還有其他上游Caspase參與激活Caspase－3，從而參與腦出血后的細胞凋亡。

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