大鼠實驗性腦梗死后AQP4表達與MRI變化的相關性研究

鹿寒冰 董瑞國 李曉賓 朱士光 郭 靖 趙 輝 莊麗麗 安曉雷 李傳玲

腦水腫是腦梗死后重要的繼發性病理改變，與梗死的預后密切相關，水通道蛋白（AQP）是近年來發現的一組與水通透有關的細胞膜轉運蛋白，是影響水跨膜轉運和細胞內外環境平衡調節的主要膜蛋白，而腦組織中的水通道蛋白主要為AQP4，可能與腦水腫的形成密切相關。MRI對腦組織含水量的變化特別敏感，腦組織含水量的增加導致T1和T 2弛豫時間延長，通過對T1和T2信號強度值的測定，可以對腦組織含水量作定量分析［1］。本研究采用MRI的T1，T2，FLAIR，DWI序列相關指標定量分析大鼠實驗性腦梗死后腦水腫的動態變化，并與AQP4的表達水平進行相關性分析，進一步探討AQP4在腦梗死后腦水腫發生、發展和演變過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的選擇 選用健康成年清潔級SD雄性大鼠45只，體質量240～300g（由徐州醫學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（蘇）2005－0005）。

1.2 動物及分組 大鼠被隨機分為假手術組15只、腦梗死組30只，兩組大鼠又各分為6h、1、3、5、7d五個亞組。

1.3 試劑與儀器 一抗（兔來源AQP4多克隆抗體）為美國Santa Cruz公司產品；二抗（二步法免疫組化試劑盒）由北京中山公司提供；生物醫學圖像分析系統為德國LEICA公司產品。

1.4 模型制作 采用改良的Zea Longa線栓法建立右側大腦中動脈阻塞模型。大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，小心游離右頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），結扎頸總動脈和頸外動脈，用直徑為0.24 mm標準魚線頭端浸蠟5 mm后插入CCA，隨后將線栓插入ICA，調整魚線方向使其避開翼腭動脈進入ICA顱內段，插入深度約定18～20 mm，遇阻力后即停止，造成局灶性腦梗死，在ICA根部結扎，假手術組為頸內動脈不插魚線，余操作同前。

1.5 試驗陽性大鼠選擇 腦梗死大鼠模型制作成功，待動物清醒后按Longa5分制標準評分：0分，無神經缺損癥狀；1分，不能伸展對側前爪；2分，向對側旋轉；3分，向偏癱側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。其中，0分及4分者被剔除，凡手術中大鼠死亡、蛛網膜下腔出血或無honer氏征者剔除，用來自同一批次的大鼠制成模型后補足數目。假手術組大鼠無明顯神經功能缺損，均入組。

1.6 MRI掃描 采用GE Signa 3.0T超導 MRI成像設備，專用動物線圈為接收線圈。大鼠俯臥位，頭置于線圈中央，自主呼吸。TIWI（IR FSE序列）：TR＝2195ms、TE＝15ms；T2WI（FSE序列）：TR＝2600ms、TE＝124ms；FLAIR （IR－FSE序列）成像：TR＝8000、TE＝133ms、TI＝2250ms；DWI（EPI序列）：TR＝2275ms，TE＝101ms，b值分別為0、1000s／mm2，冠狀面掃描，各序列采集8層，層厚2mm，間距0.2mm，矩陣256×192，FOV：6 cm×5 cm。兩組大鼠于造模后6 h、1、3、5、7 d行 MRI掃描

1.6.1 梗死體積測定 通過MRI機上的功能鍵自動測量各層感興趣區（reigion of instrest，ROI）即梗死區面積，其中梗死6 h時在DWI序列上測量，其它時間點在FLAIR序列上測量，按公式［2］：梗死體積＝各層面積之和×（層厚＋層間距）－首尾兩層面積之和×1／2層間距。

1.6.2 T1WI、T2WI、FLAIR、DWI序列SIR的測定 各序列分別通過MRI機上的功能鍵自動測量各層梗死區的平均信號強度值（signal intensity，SI），并同時測量對側相應區域的SI，得出兩側半球各層感興趣區的平均SI值（即各層感興趣區的SI值之和除以層數），繼而算出信號強度比SIR（即病灶側平均SI／對側平均SI），來反應腦梗死的相對含水量。假手術組在與梗死組相對應層面隨機取感興趣區，測量信號強度值，除以對側相應區域信號強度值，得出信號強度比。

1.7 組織切片制備 兩組大鼠MRI掃描后，常規左心室灌注固定，取右側大腦，在于視交叉處斷開鼠腦，以此切片為標準冠狀切面，然后向后再切成5mm冠狀切片，用冰凍切片機連續冠狀位切片，片厚30μm，進行免疫組化染色。

1.8 免疫組化染色 采用Power Vision TM二步法進行免疫組化染色。冰凍切片用3%過氧化氫孵育5min，以阻斷內源性過氧化物酶，一抗（濃度為1∶150）為兔來源 AQP－4多克隆抗體 （美國Santa Cruz公司）室溫下孵育60min，按二步法免疫組化試劑盒（北京中山公司）說明書進行操作；DAB顯色時間統一為3 min，顯色后光鏡觀察。陰性對照用PBS代替一抗進行孵育。.

1.9 圖像分析 采用Leica Qwin生物醫學圖像分析系統進行染色深淺定量分析，用灰度值（OD value）表示。每只大鼠各取2張切片，每張切片在右側大腦皮質大腦中動脈分布區取3個區域測量其平均灰度值，然后減去各自相同區域背景區平均灰度值，取其負數，使均為正數值，兩張切片的均值作為最終平均灰度值。

1.10 統計學處理 采用SPSS12.0軟件，兩組均數間的比較采用兩個獨立樣本的t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法，直線相關分析采用pearson法。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 假手術組信號強度 假手術組大鼠左右側大腦半球各序列信號強度相比差異均不明顯（P均＞0.05）。

2.2 腦梗死體積測定 腦梗死模型大鼠在造模后6h，在DWI序列即開始出現梗死灶，至1d時梗死體積明顯增大，在3d時達到高峰，之后逐漸減小，至7d時仍高于6h時的梗死體積，不同時間點間比較差異明顯（F＝58.367，P＜0.01）（圖1～7）。

2.3 T1WI，T2WI，FLAIR序列SIR的測定 腦梗死模型大鼠在梗死后不同時間點間，在T1WI T2WI、FLAIR、DWI各序列上SIR差異均明顯（F＝27.790、231.886、86.135、23.467；均 P＜0.01）（表1、2、3、4）。

圖1 不同時間點梗死體積測定（±s）

圖2 腦梗死后6h T1 WI可見略低信號梗死灶；圖3 腦梗死后6h T2 WI與前同一層面，可見略高信號梗死灶；圖4 腦梗死后6h DWI與前同一層面，可見明顯高信號梗死灶；圖5 腦梗死后3d T2 WI可見體積明顯增大的梗死灶，信號強度較6h時增高；圖6 腦梗死后3dDWI與前同一層面，可見體積明顯增大的梗死灶，信號強度較6h時增高；圖7 腦梗死后7d T2 WI可見梗死灶體積較3d時縮小，信號強度較3d時降低

表1 兩組大鼠腦梗死后不同時間點T1 WI序列信號強度比（±s，%）

表1 兩組大鼠腦梗死后不同時間點T1 WI序列信號強度比（±s，%）

注：與假手術組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n T1 WI序列信號強度比6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術組 15 99.26±0.41 97.34±0.99 101.37±158 100.39±2.98 99.37±1.95腦梗死組 30 96.68±2.41＊ 88.91±1.32＊＊ 83.87±2.03＊＊ 87.46±2.04＊＊ 89.15±1.43＊＊

表2 兩組大鼠腦梗死后不同時間點T2 WI序列信號強度比（±s，%）

表2 兩組大鼠腦梗死后不同時間點T2 WI序列信號強度比（±s，%）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01

組別 n T2 WI序列信號強度比6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術組 15 100.70±1.91 102.33±1.14 101.37±3.74 102.13±2.58 100.40±2.53腦梗死組 30 106.29±1.69＊ 129.83±2.71＊ 161.66±4.40＊ 148.93±3.21＊ 138.87±4.08＊

表3 兩組大鼠腦梗死后不同時間點FLAIR序列信號強度比（±s，%）

表3 兩組大鼠腦梗死后不同時間點FLAIR序列信號強度比（±s，%）

注：與假手術組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n FLAIR序列信號強度比6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術組 15 102.86±1.74 98.83±4.48 99.67±2.61 99.70±3.75 100.85±2.61腦梗死組 30 108.21±4.85＊ 119.64±2.69＊＊ 146.58±4.54＊＊ 132.30±2.93＊＊ 128.06±1.46＊＊

表4 兩組大鼠腦梗死后不同時間點DWI序列信號強度比（±s，%）

表4 兩組大鼠腦梗死后不同時間點DWI序列信號強度比（±s，%）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01

組別 n DWI序列信號強度比6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術組 15 101.65±8.68 107.76±7.11 107.16±12.49 105.59±4.94 104.57±3.53腦梗死組 30 147.89±5.25＊ 169.72±8.22＊ 182.63±4.01＊ 164.69±3.62＊ 148.12±3.14＊

2.4 腦梗死區皮層AQP4的表達水平 在腦梗死后6 h梗死側大腦AQP4表達水平即增高，主要位于星形膠質細胞終足包繞毛細血管壁形成的一層膠質界膜上，隨著梗死時間的延長其表達亦明顯增強，第3 d達高峰，以后逐漸下降，7 d時仍高于假手術組；各時間點腦梗死組AQP4的表達水平均明顯高于假手術組（P＜0.01）；不同時間點間比較假手術組AQP4的表達水平差異不明顯（F＝0.341，P＞0.05），而腦梗死組各時間點間差異明顯（F＝28.489，P＜0.01）（表5）。

表5 腦梗死側大腦皮層AQP4表達水平的動態變化（±s，OD值）

表5 腦梗死側大腦皮層AQP4表達水平的動態變化（±s，OD值）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01

組別 n AQP4表達水平6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術組 15 3.58±1.04 3.14±0.71 3.78±1.02 3.20±0.45 3.36±0.56腦梗死組 30 11.26±1.75＊ 14.86±1.25＊ 19.41±2.48＊ 12.19±1.18＊ 10.66±1.16＊

2.5 腦梗死體積與AQP4表達水平的相關性分析

腦梗死組大鼠各時間點病灶側半球腦梗死體積與相應時間點大腦皮層AQP4表達水平的平均灰度值呈正相關（r＝0.575，P＜0.01）。

2.6 T1WI、T2WI、FLAIR、DWI序 列 SIR 與AQP4表達水平的相關性分析 將腦梗死組大鼠各序列不同時間點的序列SIR與相應時間點病灶側大腦皮層AQP4表達水平的平均灰度值進行相關性分析，顯示T1WIT的信號強度比與AQP4的表達水平呈負相關（r＝－0.610；P＜0.01），T2WI、FLAIR、DWI序列的信號強度比均與AQP4的表達水平 呈 正 相 關 （r＝0.586、0.668、0.795；P 均＜0.01）。

3 討 論

本研究通過MRI對大鼠腦梗死模型進行研究，為了減少MRI機器不穩定性、周圍環境的變化、電源電壓的波動等因素造成的系統誤差，本實驗參照朱國行等實驗的測量計算方法，采用信號強度比的計算［3］，這樣可減少每次檢查時老鼠體位差別以及掃描層面不完全一致所造成的人為誤差。DWI（彌散加權成像）是對水分子的橫向彌散運動特別敏感的成像技術，在局部腦組織缺血后30 min內MRI可見水的彌散作用減低，出現高信號改變，主要反映急性期的細胞毒性腦水腫，而常規T2WI在動脈阻塞3～4 h才出現高信號［4］。本實驗發現腦梗死后6 h在T1WI、T2WI、FLAIR序列腦梗死灶表現尚不明顯，梗死灶的范圍亦不易確定，而DWI上已經出現了較明顯的高信號梗死灶，故本實驗在腦梗死后6 h在DWI序列上測量腦梗死體積，而在其它時間點DWI序列梗死灶的范圍沒有T2WI、FLAIR序列清晰，本實驗中DWI序列在各個時間點圖像均有不同程度的變形與偽影，可能與大鼠腦體積較小、彌散加權圖像的空間分辨率有限、磁敏感效應易造成高信號偽影等有關，因此在應用彌散加權圖像診斷腦梗死的同時應結合常規 MRI，以避免假陽性。FLAIR序列由于抑制了腦脊液的信號，同時增加了T2權重成分，背景信號減低，增加了病灶與正常組織間的對比以及與腦脊液的對比，對靠近腦脊液的區域如皮層、腦室旁的病變的顯示大為改善，故本實驗在腦梗死后1、3、5、7d采用在FLAIR像上測量梗死體積的變化來反應腦水腫的吸收情況。

AQP4為水分子轉運通過細胞膜脂質雙分子層的一種膜蛋白，腦組織中的AQP主要為AQP4，在面向毛細血管內皮細胞、軟腦膜和腦室室管膜側膠質細胞的細胞膜或足突上表達明顯［5］。本實驗結果亦顯示AQP4在大腦皮層中毛細血管周圍的星形膠質細胞終足上表達豐富，同時皮層邊緣軟腦膜下及腦室周圍的膠質細胞界膜上也有表達。

近期許多研究表明，AQ4的表達與腦水腫密切相關［6］。Taniguchi等的研究發現，大腦中動脈阻塞后AQP4 mRNA的表達上調，第3 d達高峰，第7 d仍處于較高水平，皮質的分子層和外顆粒層可見AQP4 mRNA及蛋白質表達最強［7］。陳英輝等的實驗發現，AQP4表達水平在大鼠腦缺血再灌注后6 h即開始增高，隨再灌注時間的延長，其表達量逐漸增加，再灌注24～48 h達到高峰，其表達與腦組織含水量和伊文氏藍水平呈正相關，提示AQP4表達參與了腦缺血再灌注后繼發血腦屏障的開放和腦水腫的發生［8］。張新宇等通過在大鼠腦內注射TNF－α后，發現早期就可出現腦水腫，并測得AQP4表達明顯上調、BBB通透性顯著增加，且二者呈顯著正相關，推測TNF－α通過多種途徑破壞BBB，繼而誘導AQP4表達上調，進一步加重腦水腫形成惡性循環［9］。黃垂學等采用自由落體硬膜外撞擊法致大鼠重度腦創傷模型進行實驗發現，腦損傷后4 h，腦組織中AQP4表達開始上調，1 d后達高峰，持續3 d后下降，7 d時接近假手術組水平［10］。

本研究結果顯示AQP4的表達水平與MRI上病灶側半球腦水腫體積、T2WI、FLAIR、DWI序列平均SIR值呈正相關，與T1WI序列的SIR呈負相關。T2WI對組織總含水量增加的血管源性水腫敏感［11］，這亦從側面說明了AQP4的表達水平與血腦屏障破壞導致的血管源性腦水腫有關。DWI的高信號改變主要反映急性期的細胞毒性腦水腫，本實驗在腦梗死后的急性期與亞急性早期AQP4的表達水平與DWI的平均SIR值呈正相關，說明AQP4的表達水平與腦梗死后細胞毒性腦水腫的形成發展亦密切相關。本實驗結合MRI的各項腦水腫指標從多個方面說明腦梗死后AQP4的表達促發了缺血性腦水腫的形成與發展，且腦梗死后AQP4的過度表達可能與血管源性腦水腫及細胞毒性腦水腫形成與發展均相關。

AQP4在腦中作用的具體機制及其表達調控的機制還不十分明確，且存在很大的分歧，需要進一步的實驗研究來證實。針對AQP4進行調控從而為臨床治療腦水腫研提供新的思路與理論依據的研究具有越來越廣闊的前景。由于研究技術、設備的限制，對超早期（＜6 h）的梗死尚未進行研究，隨著MRI設備的更新和新技術的發展，平面回波（EPI）／T2＊ WI、梯度回波 （GRE）／T2＊ WI、灌注成像（PWI）和MR波譜（MRS）等的運用，還可對缺血周圍的血流、理化性質改變等作進一步的分析，將有利于對腦梗死后腦水腫的形成機制及治療作更深層次的研究。

1 Lin W，Venkatesan R，Gurleyik K，et al.An absolute measurements of water content using magnetic resonance imaging in two focal cerebral ischemic rat models.Cereb Blood Flow Metab，2000，20（1）：37－44.

2 李曉賓，董瑞國，程廣軍，等.應用MRI動態評估亞低溫對大鼠出血性腦水腫的干預效應.中國臨床康復，2006，10（18）：82－85.

3 朱國行，姚景莉，秦 震，等.甘露醇治療腦血管病性腦水腫的MRI研究.中國神經精神疾病雜志，1997，23（5）：286－288.

4 Thomas M，Ringer MD，Tobias Neumann－Haefelin MD.Reversal of early diffusion－weighted magnetic resonance imaging abnormalities does not necessarily reflect tissue salvage in experimental cerebral ischemia.Stroke，2001，32（10）：2362－2367.

5 Manley GT，Fujimura M，Ma T，et al.Aquaporin－4 deletion in mice reduces brain edema after acute water toxication and ischemic stroke.Nat Med，2000，6（2）：159－163.

6 Papadopoulos MC，Verkman AS.Aquapofin－4 and brain edema.Pediatr Nephrol，2007，22（6）：778－862.

7 Taniguchi M，Yamashita T，Kumura E，et al.Induction of aquaporin－4 water channel mRNA after forcal cerebral ischemia in rat.Brain Res Mol Brain Res，2000，78（1－2）：131－137.

8 陳英輝，趙永波，咼登俊，等.水通道蛋白4在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用.臨床神經病學雜志，2006，19（3）：197－199.

9 張新宇，孫曉川.腫瘤壞死因子α誘發腦水腫的機制.重慶醫科大學學報，2008，33（4）：432–436.

10 黃垂學，李俊駒，趙建農，等.腦損傷后水通道蛋白4表達與血腦屏障通透性的關系.中華神經外科疾病雜志，2008，7（3）：205－208.

11 Burdette JH，Elster AD，Ricci PE，et al.Acute cerebral infarction：Quantification of spin－density and T2“shine－through”phenomenon on diffusion－weighted MR images.Radiology，1999，212（2）：333－339.