巴曲酶對大鼠腦缺血再灌注Fas基因和FasL基因表達變化的影響

白文婷

腦缺血再灌注后以神經元為主的壞死和細胞凋亡是缺血性腦損傷中重要的病理生理過程,其中細胞凋亡的重要作用越來越受到人們重視。導致細胞凋亡的通路有多條,其中Fas和FasL系統是細胞凋亡中最重要的途徑之一[1,2]。巴曲酶是目前比較公認的治療缺血性腦血管病的藥物之一,本研究從基因表達角度觀察巴曲酶對腦缺血再灌注損傷后Fas、FasL基因較表達水平的影響,為臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 選用健康W ister大鼠40只,雌雄不拘,體質量200～250 g,由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供,并隨機分為5組,即Ⅰ組為假手術組,Ⅱa組為等滲鹽水缺血6 h組,Ⅱb為等滲鹽水缺血6 h再灌注6 h組(分別于缺血后2 h予以腹腔注射0.9%生理鹽水1 m l),Ⅲa組為巴曲酶缺血6 h組,Ⅲb組為巴曲酶缺血6 h再灌注6 h組[與生理鹽水組同時間同途徑注射巴曲酶注射液8 BU/kg(用生理鹽水衡釋為1 m l)],每組各8只。模型的建立參照Zez-Longe法[3,4]并改良,大鼠麻醉后分離結扎右側頸總動脈、頸外動脈,頸內動脈放置動脈夾,在近動脈分叉處約5 mm剪一小口,用直徑0.17 mm的尼龍線(頭端膨大直徑約為0.25mm)插入頸內動脈約(19.0±0.5)mm,遇阻即止,閉塞大鼠清醒后爬行時向左轉圈或提尾時左前肢內收屈曲為入組標準。每組大鼠于規定時間點快速斷頭取腦,剝取右側大腦額頂葉上部皮質,液氮中凍存。

1.2 RT-PCR法半定量Fas m RNA和FasLm RNA表達水平

1.2.1 總RNA提取 取上述樣本放入1‰DEPC處理的研缽中充分研磨后,加入 1m l Trizol試劑(美國Invitrogen),按說明書提取組織的總RNA。在質量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳,檢測RNA完整性。以 Pharmacia Biotech Gene QuantⅡ紫外分光光度計測量總RNA在260 nm和280 nm時的吸光度比值A 260/A 280。

1.2.2 逆轉錄 取1μl總RNA,采用逆轉錄試劑盒(美國Promega),應用PEK IN ELMER 480DNA擴增儀進行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3 聚合酶鏈反應 引物由上海生工公司設計合成,FasmRNA 的引物序列為 5＇-GCAATGCTTCTCTCTGTGACCACTG-3＇(上游),5＇-GCTGTTGTGCTCGATCTCA TCG-3＇(下游),產物長度為347 bp;FasLm RNA 的 引物 序列 為 5＇-ATAGAGCTGTGGCTACCGGT-3＇(上游),5＇-CTCCAGAGATCAAAGCAGTTCC-3＇(下游),產物長度為285 bp;β-actin 為內參照 ,引物序列 為 5＇-TTGTA-ACCAACTGGGACGATATGG-3＇(上 游),5＇-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3＇(下游),產物長度為760 bp。PCR反應總體積為25μl,反應條件為Fasm RNA;94℃預變性5 min;循環參數：94℃變性40 s,61℃退火1 min,72℃延伸1 min,共28個循環;最后72℃延伸 7 m in;FasLm RNA：94℃預變性5min;循環參數：94℃變性40 s,63℃退火1m in,72℃延伸1m in,共28個循環;最后 72 ℃延伸 7 m in;β-actin：94 ℃預變性 5 m in;循環參數：94℃變性40 s,55℃退火40 s,72℃延伸40 s,共 30個循環;最后72 ℃延伸7 min.取 5μl PCR擴增產物進行質量濃度為20 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L溴乙錠)電泳,電壓5 V/cm,在 WD-9403紫外線攝影儀上攝影記錄。用TotalLab軟件進行吸光度容積定量分析。

1.3 統計學處理 應用方差分析和q檢驗。

2 結 果

缺血半暗帶組織Fasm RNA、FasLm RNA的表達水平：Ⅰ組FasmRNA、FasLm RNA均未見表達,Ⅱa及Ⅱb組表達水平明顯增高,Ⅲa及Ⅲb表達水平明顯下降(圖 1、2),擴增片段分別為347 bp、285 bp、RT-PCR半定量光密度比值(Fas/β-actin m RNA 、FasL/β-actinm RA)見表 1 。

圖1 各組FasmRNA RT-PCR產物電泳圖

圖2 各組FasLmRNA RT-PCR產物電泳圖

表1 各組腦組織缺血半暗帶皮質Fasm RNA、FasLmRNA 表達水平(±s,n=8)

表1 各組腦組織缺血半暗帶皮質Fasm RNA、FasLmRNA 表達水平(±s,n=8)

注：與Ⅲa及Ⅱb組比較,*P＜0.01

組別 Fas/β-actin mRNA FasL/β-actin mRNAⅡa組 0.90±0.05 0.45±0.02Ⅱb組 0.94±0.06 0.51±0.03Ⅲa組 0.45±0.03* 0.22±0.03*Ⅲb組 0.40±0.06* 0.16±0.01*

3 討 論

Fas又稱Apo-1或CD95,是一個 45 kd的Ⅰ型膜蛋白,屬于TNF和NGF受體超家族。Fas具有1個跨膜結構,C末端位于細胞外,具有3個富含半胱氨酸結構域;細胞內存在一個誘導細胞凋亡所必須的特殊結構——凋亡結構域[5,6]。Fas配體(FasL)是一個40 kd的Ⅱ型跨膜糖蛋白,屬TNF家庭成員。成年哺乳動物正常大腦檢測不到Fas基因表達信號,而腦缺血誘發Fas基因表達。本研究結果顯示,大鼠腦缺血再灌注后 Fasm RNA和FasLmRNA的表達水平均明顯增高,這表明腦缺血再灌注的確可誘導FasmRNA、FasLmRNA在腦中表達。Fas與活化細胞交聯誘導凋亡的機制主要是細胞內酷氨酸和絲/蘇氨酸的磷酸化。凋亡信號的轉導是通過Fas與FasL結合,誘導神經鞘磷脂酶Smase的活化,分解SM生成神經酰胺(CM),CM通過膜結合性的絲/蘇氨酸蛋白激酶等激活第二信使途徑,使胞內鈣離子濃度升高引發一系列的生化反應,從而誘導凋亡發生。腦缺血后細包凋亡發生的機制尚不完全清楚,既是凋亡相關基因表達的結果,又受其他許多內外因素調節。Fas參與腦缺血后凋亡的機制可能是缺血性腦損傷后Fas和FasL均表達,在原位直接導致細胞凋亡;表達Fas血細胞通過血-腦屏障與表達FasL的神經細胞相遇,或表達FasL的血細胞與表達Fas的神經細胞相遇,將造成神經細胞的死亡;可能其他細胞因子可以上調Fas的表達,促進細胞凋亡過程。總之,這其中的機制還有待于進一步研究。

巴曲酶(DF-521)是由生物合成的一種高純度類凝血酶樣物質,屬于糖蛋白,其肽鏈由231個氨基酸組成,分子量36000,是目前比較公認的治療缺血性腦血管病的藥物之一,如降低纖維蛋白原含量、改善循環等,DF-521還具有減少缺血性腦血管病后的神經細胞壞死和凋亡數量、多層次多途徑的神經保護作用[7,8]。巴曲酶能否通過抑制腦缺血再灌注后FasRNA和FasLm RNA表達來減少細胞壞死和凋亡而起到腦保護作用呢?本試驗結果顯示Ⅱa及Ⅱb組表達水平明顯增高,Ⅲa及Ⅲb組表達水平明顯下降,并且兩組相比有顯著差異(P＜0.01)。因此,本研究認為巴曲酶對Fasm RNA和FasLm RNA表達有抑制作用,也就是說它有可能通過抑制Fasm RNA和FasLm RNA表達而起到腦保護作用,這其中的詳細作用機制還不十分清楚,有待進一步研究。

1 魏家臣.Fas/FasL介導凋亡細胞機制及其病理生理意義.國外醫學-外科學分冊,2003,1(3)：21-23.

2 劉 涌,胡明均,何國厚.Fas/FasL的高表達在缺血性腦損傷中的意義.中國臨床康復,2003,7(31)：4184-4185.

3 Longa EZ,Weinstein PN,Carlson S,et el.Reversiblem iddle cerebralartery occlusionW ithout craniotomy in rats.Stroke,1989,20(2)：84-91.

4 范紅杰,于維東,歐陽巍.栓線法建立大腦中動脈局灶缺血實驗模型對再灌注損傷的評價意義.中國臨床康復,2003,7(16)：2292-2293.

5 m rtin A,H err I,Jerem ias I,et al.CD 95 ligand(Fas-L/APO-IL)and TNF-related apoptosis-inducing ligand mediate is-chem ia-induced apoptosis in neu rons.JNeu rosci,1999,19(4)：3809-3817.

6 于新路,王 和,張 波.大鼠腎缺血/再灌注損傷不同時相Fas,FasL蛋白表達及意義.中國臨床康復,2003,7(2)：350-351.

7 蘇志強,劉亢丁,饒明俐.不同劑量巴曲酶對大鼠局灶性腦缺血再灌流后細胞凋亡的影響.中風與神經疾病雜志,2001,18(1)：10-11.

8 吳惠民.巴曲酶和奧扎格雷鈉治療腦血栓.中國實用神經疾病雜志,2007,10(9)：78-79.