18β-GA對人高轉移卵巢癌HO-8910PM細胞增殖、黏附和侵襲能力的影響

陳 杰，龐江琳，覃燕梅，梁念慈

(1廣東醫學院，廣東湛江524023;2廣東醫學院附屬醫院)

惡性卵巢腫瘤是威脅婦女健康的常見疾病，早期不易發現，惡性程度高，有效的抑制腫瘤侵襲和轉移是提高患者生存率的關鍵［1］。2008年2月 ～2010年5月，我們觀察了18β-甘草次酸(18β-GA)對人高轉移卵巢癌HO-8910PM細胞增殖、黏附和侵襲能力及黏附斑激酶(FAK)、基質金屬蛋白酶(MMP)-9表達的影響，旨在為進一步研究18β-GA抑制腫瘤細胞生長的機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 人高轉移卵巢癌細胞系(HO-8910PM)是本細胞培養室從上海細胞生物所引進，由浙江省腫瘤研究所許沈華等建立;超級小牛血清(杭州四季青公司)，RPMI1640培養基(Gibco公司)，Fibronectin(Sigma公司)，Matrigel(BD 公司)，Transwell板(Corning公司)，FAK、MMP-9 抗體(Santa Cruz公司);18β-GA(中國生物制品檢定所，使用時，用DMSO配成原液，分裝凍存，臨用前用無血清培養基稀釋成所需濃度)。

1．2 實驗方法

1．2．1 細胞培養 HO-8910PM細胞培養于含10%小牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養基中，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱培養。細胞經過消化傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1．2．2 細胞增殖抑制率檢測 采用MTT法。取對數期生長期HO-8910PM細胞，經胰酶消化。調整細胞濃度5×104/ml，接種于96孔培養板內，每孔90 μl，培養過夜，實驗組加入 12．5、25．0、50．0、100．0 μmol/L 的 18β-GA 10 μl，對照組加入 10 μl 培養基，每組設5個平行孔，并設RPMI1640完全培養基調零孔，置培養板于孵箱中6、48 h，每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，避光繼續培養4 h。棄培養液，每孔加入150 μl DMSO溶解，用微量振蕩器搖振15 min，用酶標儀測定570 nm處吸光度(OD值)，參考波長為450 nm，實驗重復3次。細胞增殖抑制率(%)=(1－實驗組細胞 OD值/對照組細胞 OD值)×100%。

1．2．3 細胞侵襲抑制率檢測 在Transwell小室上膜的外表面涂 Fibronectin 4．5 μg(10 μl)，置超凈臺內風干，膜內表面涂 Matrigel 5 μg(10 μl)，使之干燥，形成人工重組基底膜;在24孔板內加入0．1%BSA-RPMI1640培養基，每孔 700 μl，用胰酶消化收集對數生長期的 HO-8910PM細胞，懸浮于0．1%BSA-RPMI1640培養基中，使終濃度為1×106/ml;將Transwell小室浸于24孔板的條件培養基中，將細胞懸液加入 Transwell小室中，每小室100 μl，實驗組加入 50．0、100．0 μmol/L 的 18β-GA 1 μl，對照組加入等量的PBS。37℃、5%CO2溫箱內孵育6 h。將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定1 min，Hematoxiline染色 3 min，水洗，eosin 染色10 s，水洗，用生理鹽水浸濕的棉簽擦去濾膜內表面的細胞;用封片膠將濾膜封于載玻片上，于400×顯微鏡下計數穿過PVPF濾膜的細胞數。每膜計數上下左右中5個隨機不同視野，每組平行設3個濾膜。侵襲抑制率(%)=(1－實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數)×100%。

1．2．4 細胞黏附抑制率檢測 96孔培養板每孔預鋪 Matrigel 10 μg/50 μl，置超凈臺內風干;培養板用2%BSA 20 μl/孔封阻，置37℃培養箱中保溫孵育1 h，PBS沖洗并棄去;收集對數生長期的HO-8910PM細胞，懸浮于含RPMI1640完全培養基中，終濃度為8 ×105/ml，每孔加入 100 μl，實驗組同時加入上述濃度藥物1 μl，設溶劑對照和總細胞組，并設RPMI1640培養基調零孔，37℃培養1 h;棄培養液，以PBS液輕輕沖洗3遍除去未黏附細胞(總細胞組不經PBS吹洗);棄去PBS，每孔加入100 μl RPMI1640培養基和50 μl MTT(1 mg/ml)，繼續培養4 h。傾去MTT，每孔加入150 μl DMSO溶解，用微量振蕩器搖振15 min，用酶標儀測定其吸光度。每組平行設3個孔，實驗重復3次。黏附抑制率(%)=(1－實驗組黏附細胞OD值/對照組黏附細胞OD值)×100%。

1．2．5 FAK、MMP-9表達檢測 采用 Western blot法。取各組細胞，提取并定量蛋白，上樣，電泳，轉膜，封閉，一抗37℃孵育2 h，二抗孵育2 h，洗膜，ECL曝光，顯影。目的蛋白相對含量以目的蛋白/βactin(內參)的灰度值表示。

1．3 統計學方法 采用SPSS12．0統計軟件，計量數據以±s表示，各組間差異檢驗用方差分析。檢驗水準 α =0．05。

2 結果

2．1 細胞增殖抑制率 見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率比較(%，±s)

表1 各組細胞增殖抑制率比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05;與6 h比較，△P ＜0．05;各濃度組間兩兩比較，▲P ＜0．05

組別6 h 48 h實驗組12．5 μmol/L 1．73 ±0．20 11．39 ±0．77＊△▲25．0 μmol/L 3．78 ±1．15 26．91 ±0．66＊△▲50．0 μmol/L 7．74 ±1．14 36．52 ±0．66＊△▲100．0 μmol/L 9．82 ±2．17 63．14 ±0．11＊△▲對照組00

2．2 細胞侵襲抑制率、黏附抑制率 見表2。

表2 實驗組和對照組細胞侵襲抑制率、黏附抑制率比較(%，ˉx ±s)

2．3 FAK、MMP-9蛋白表達 見表3。

表3 實驗組和對照組FAK、MMP-9蛋白表達比較(%，ˉx ± s)

3 討論

18β-GA是甘草中所含三萜類化合物甘草甜素(即甘草酸鹽)水解后脫去兩分子葡萄糖醛酸的產物。18β-GA具有抗炎、抗氧化、抗過敏、降血脂、鎮咳、平喘、祛痰、治療糖尿病、抗DNA損傷等作用。近年來，18β-GA與腫瘤相關的研究逐漸增多。18β-GA具有抑制腫瘤細胞增殖及誘導其凋亡作用，但對卵巢癌轉移的作用機制仍然不清楚。

FAK是一種多功能的非受體酪氨酸激酶，在受到原癌基因產物和胞外基質整合素的刺激后發生磷酸化而活化［2］。研究表明，FAK在多種侵襲和轉移性腫瘤中高表達，提示其在腫瘤的侵襲和轉移中起到重要的作用［3］。FAK是胞內外信號轉導的中樞，它的激活主要靠Tyr397快速磷酸化，其激活可介導整合素、FAK/Src激酶、FAK/Ras蛋白/MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)及FAK/Rho激酶等多條信號傳導途徑參與細胞的分化、增生及腫瘤的黏附、侵襲與轉移等過程［4］。在惡性神經角質瘤中，下調FAK及整合素連接激酶的表達，可減少富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白介導AKT活化，從而減少腫瘤黏附、侵襲和轉移［5］。另外，FAK 中 Tyr397、Tyr576、Tyr861 位點的活化和磷酸化可促進結腸癌的侵襲和轉移。

研究發現，腫瘤轉移的最初步驟是腫瘤細胞的黏附和降解細胞外基質和基底膜，這一過程依賴于細胞外蛋白水解酶的作用。其中，最重要的蛋白水解酶是MMP。MMP-9是基質金屬蛋白MMPs家族的重要一員，在直腸癌、胰腺癌、肺癌等多種實體腫瘤的癌細胞和細胞外基質中均存在高表達［6］，其過度表達與腫瘤的遠處轉移及周圍組織的侵襲密切相關［7］。MMP-9能特異性降解細胞外基質，破壞基底膜的完整，導致腫瘤細胞向周圍組織浸潤并侵入血管和淋巴管，向遠處轉移［8］。

研究證實，在腫瘤侵襲轉移過程中，FAK與MMP-9的作用關系密切，FAK促進粘連蛋白介導的肺癌轉移，是通過激活ERK1/2信號通路來調控MMP-9和calpain-1的表達而實現的［9］;MMP-9激活是通過ERK1/2信號通路實現的。本研究發現，18β-GA作用后HO-8910PM細胞的黏附能力、侵襲能力受到抑制，其可能機制是通過抑制FAK的表達，繼而抑制ERK1/2的通路，減少MMP-9的表達;18β-GA可明顯抑制高轉移HO-8910PM細胞生長增殖、黏附和侵襲能力;其機制可能為下調FAK、MMP-9蛋白的表達。

總之，18β-GA能抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和黏附;可能成為潛在的抗卵巢癌中藥，更多的機制有待進一步研究。

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