浸潤性乳腺癌組織中14-3-3σ、p73α蛋白表達及臨床意義

姚 萍，劉 廷，趙樹鵬，高 源，齊鳳杰*

(1遼寧醫(yī)學院病理教研室，遼寧錦州121001;2遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院;3遼寧醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎教研室)

乳腺癌是婦女常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因參與的復雜過程，包括多種癌基因的激活和抑癌基因的失活，這些基因之間的相互作用及異常改變與乳腺癌密切相關(guān)。近年來，我們觀察了表皮細胞特異性標志物14-3-3σ、p73α蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達情況，旨在為乳腺癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供可能的分子生物學指標。

1 材料與方法

1．1 材料 選擇我院2006年5月～2011年2月手術(shù)切除的浸潤性乳腺癌組織標本94份(浸潤癌組)，患者年齡24～79歲，中位年齡52歲;均經(jīng)病理證實且未進行放化療及內(nèi)分泌治療。腫瘤直徑≤2 cm 41例，＞2 cm 53例;腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例;ER受體陽性50例;PR受體陽性69例;HER-2受體陽性34例;按UICC 2003年TNM分期Ⅰ期29例，Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ期25例;根據(jù)2003年WHO乳腺癌分類非特殊型浸潤性導管癌(組織學分級Ⅰ、Ⅱ級40例，Ⅲ級16例)56例，浸潤性小葉癌18例，特殊型浸潤性導管癌(黏液腺癌4例、髓樣癌16例)20例。另選同期手術(shù)切除的導管原位癌標本15份(原位癌組)，上皮不典型增生標本15份(不典型增生組)，導管內(nèi)乳頭狀瘤標本15份(乳頭狀瘤組)，乳腺增生癥標本20份(增生癥組)，乳腺癌旁5 cm標本10份(癌旁組)，各組一般資料無統(tǒng)計學差異。試劑:兔抗人p73α多克隆抗體(1∶100，武漢博士德生物公司)，鼠抗人14-3-3σ多克隆抗體(1∶100，北京中杉金橋生物公司)，PV-9000免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。

1．2 14-3-3σ、p73α 蛋白表達檢測 采用免疫組織化學PV-9000兩步法。4 μm切片脫蠟至水。置于3%H2O2內(nèi)10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。抗原高壓熱修復后，自然冷卻，滴加一抗，4℃冰箱過夜;PBS液沖洗2 min 3次，滴加試劑1(聚合物輔助劑)，37℃溫箱內(nèi)孵育20 min;PBS液沖洗2 min 3次，滴加試劑2(辣根酶標記羊抗鼠IgG多聚體)，37℃溫箱內(nèi)孵育30 min;PBS液沖洗2 min 3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗、蘇木精復染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。每批均設(shè)已知陽性切片作對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定標準:14-3-3σ與p73α陽性表達均定位于導管和小葉上皮細胞胞質(zhì)，出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽性。由2位以上病理醫(yī)師采用雙盲法觀察。每切片隨機選取5個高倍視野(×400)，共計數(shù)1 000個細胞。按陽性表達(A)及染色強度(B)評分，A評分:陰性為0分，陽性細胞率≤10%為1分，10% ～50%為2分，＞50%為3分;B評分:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。A×B記陽性標記指數(shù)(LI)，指數(shù)為0計為陰性(－)，1～3為弱陽性(+)，4～6為中等陽性(++)，7～9為強陽性(+++)。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件，各組間率比較采用χ2檢驗，14-3-3σ、p73α蛋白間關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析法。檢驗水準α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 14-3-3σ、p73α 蛋白表達 浸潤癌組、原位癌組、不典型增生組、乳頭狀瘤組、增生癥組、癌旁組的14-3-3σ 蛋白陽性率分別為 29．8%、66．7%、73．3%、86．7%、95．0%、80．0%，浸潤癌組陽性率明顯低于其余各組，P均＜0．05;p73α蛋白陽性率分別為 77．7%、53．3%、40．0%、26．7%、10%、0，浸潤癌組陽性率明顯高于其余各組，P均＜0．05。

2．2 14-3-3σ、p73α蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 14-3-3σ和p73α蛋白表達與浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2．3 相關(guān)性分析 浸潤性乳腺癌中14-3-3σ和p73α 蛋白表達呈負相關(guān)(r= －0．823，P=0．000)。

3 討論

14-3-3蛋白于1967年在動物大腦組織中發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，14-3-3蛋白家族包括7種亞基(β、γ、ε、η、ζ、σ 和 τ/θ)，其中 14-3-3σ 與腫瘤的關(guān)系最密切［1］，是14-3-3家族中惟一一個能夠被 DNA損傷所誘導的成員。14-3-3σ主要受抑癌基因p53調(diào)控［2］，作為一個細胞周期負調(diào)控因子，起活化可以引起細胞周期G2/M期阻滯，以發(fā)揮抑癌基因作用。14-3-3σ直接參與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，已有報道在多種人類惡性腫瘤中常有其蛋白或基因表達異常。14-3-3σ在乳腺癌中表達尚存爭議，有研究認為其表達隨乳腺癌的惡性進展呈下降趨勢，而Moreira等報道14-3-3σ蛋白在乳腺癌中表達下調(diào)只是偶發(fā)事件。本研究顯示，浸潤癌組陽性率明顯低于其余各組，提示14-3-3σ可能是一種保護性蛋白，在抑制乳腺細胞異常增生和惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用，其表達缺失可能與浸潤性乳腺癌有關(guān)。Simooka等［3］發(fā)現(xiàn)，14-3-3σ蛋白表達隨著腫瘤發(fā)展進行性下降，證實14-3-3σ作為腫瘤抑制因子存在于乳腺癌組織中。本研究還發(fā)現(xiàn)，14-3-3σ蛋白陽性表達與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2受體、組織學分級、TNM分期相關(guān)，而與年齡、腫瘤直徑、組織學類型及PR、ER受體無關(guān)，提示14-3-3σ蛋白可能參與了乳腺癌的發(fā)生，且與其惡性程度、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。

p53基因具有野生型、突變型兩種。野生型為抑癌基因，編碼蛋白p53，具有“基因衛(wèi)士”的作用，通過多種方式誘導DNA損傷細胞的凋亡;其在細胞中含量低，半衰期為20～30 min，很難檢測，突變型p53蛋白含量高且半衰期長，可用免疫組化方法檢測，因此細胞內(nèi)p53陽性表達常被用于p53基因突變的檢測。作為經(jīng)典的抑癌基因，p53基因突變與近半數(shù)人類原發(fā)腫瘤的發(fā)生高度相關(guān)。

p73基因是Kaghad等在1997年發(fā)現(xiàn)的一個新基因，其編碼序列與p53基因具有相當?shù)耐葱裕瑩?jù)此將其命名為p73基因。其表達蛋白產(chǎn)物為TAp73和DNp73［4］，TAp73在結(jié)構(gòu)上與 p53具有高度同源性，為p73蛋白羧基端選擇性剪切形成，共有α、β、γ、δ、ε、ζ 等6種同源異構(gòu)體，其中 p73α 以全長 mRNA形式表達。p73基因定位于人染色體1p36．33，是人1號染色體短臂(1p36)中一部分，研究提示該區(qū)可能隱藏多個抑癌基因。p73基因的特殊定位，支持其可能是一個新型的抑癌基因［5］。但在已檢測的如乳腺癌、肺癌、神經(jīng)母細胞瘤、肝癌及前列腺癌等人類腫瘤組織和細胞株中p73基因表達增高，且均未發(fā)現(xiàn)p73基因的突變［6］。其表達增高的機制還不明確，可能與 p53的突變和失活有關(guān):Dominguez等［7］通過檢測70例乳腺癌標本中 p73 mRNA的表達水平和1p36的雜合性缺失(LOH)，發(fā)現(xiàn)33%p53的組化染色陽性病例存在p73過表達，且兩者差異有統(tǒng)計學意義。說明p73作為p53家族中的成員可代替突變型p53，調(diào)節(jié)其下游基因發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用。耿翠芝等［8］和 Wakatsuki等［9］也分別證實，在p53缺失或者突變的乳腺癌細胞系中和放療誘導細胞凋亡前后的68例宮頸鱗癌患者中，p73α表達上調(diào)，說明p73α能夠補償p53的缺失而發(fā)揮與其類似的抑癌功能，誘導14-3-3σ的表達，抑制腫瘤細胞生長。本研究顯示，浸潤癌組p73陽性率明顯高于其余各組，提示確實存在p73α蛋白的高表達;并且在p53陽性的乳腺癌中，p73α顯著高表達，14-3-3σ表達與p73α呈正相關(guān)，驗證了上述p73α補償上調(diào)14-3-3σ的觀點。而浸潤癌中14-3-3σ與p73α蛋白表達呈負相關(guān)，可能與本研究中p53陽性者比例有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，p73α蛋白與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER及PR受體、TNM分期相關(guān)，提示p73α基因的高表達可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，并對乳腺癌的激素治療有一定意義。

總之，14-3-3σ和p73α蛋白與浸潤性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測可為乳腺癌早期診斷和治療提供參考。

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