不同劑量辛伐他汀對多柔比星導致的乳鼠心肌細胞損傷的保護作用

潘建業，陳 星，顧 琳，王 好，張國輝

(鎮江市第一人民醫院，江蘇鎮江212002)

多柔比星(DOX)屬蒽環類抗生素，在臨床上廣泛用于治療多種惡性腫瘤，但該藥存在心臟毒性，長期應用可導致心肌功能障礙，甚至心力衰竭［1］。近年來，多項研究發現他汀類藥物除具降脂作用外，還可明顯改善心衰患者及動物的心功能［2］。2010年10月～2011年9月，我們觀察了辛伐他汀(SIM)對DOX損傷乳鼠心肌細胞的保護作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1．1 材料 新生SD大鼠，1～3 d，雌雄不拘，由江蘇大學動物實驗中心提供。DOX(美國 Enzo公司)，SIM標準品、胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)，DMEM-F12培養基(美國Gibco公司)，小牛血清(美國Hyclone公司)，Annexin V/PI雙染凋亡試劑盒(南京凱基生物有限公司)，一抗RyR2(美國Abcam公司)。其他試劑均為分析純。

1．2 實驗方法

1．2．1 細胞培養及干預 參照參考文獻［3］的方法稍加改進，獲取大鼠心肌細胞，按5×105的密度接種于6孔板(凋亡率觀察時)、24孔板(RyR2蛋白檢測時)中，37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。72 h的心肌細胞隨機分為五組，對照組不予任何藥物;DOX組予濃度為1 μmol/L 的 DOX 2 ～3 ml，SIM 低、中、高劑量組應用DOX 基礎上分別予濃度為1、10、20 μmol/L的SIM 2～3 ml。繼續培養24 h。

1．2．2 觀察項目 ①搏動頻率:倒置相差顯微鏡下觀察。②凋亡率:干預后各組細胞均接種于6孔板中，0．25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min 離心5 min，加入Binding Buffer混勻懸浮細胞;避光條件下先后加入Annexin V-FITC和PI，用流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。③RyR2蛋白表達:用Western blot法檢測。提取各組心肌細胞總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白轉入PVDF膜，將PVDF膜室溫封閉2 h后加入一抗，4℃冰箱過夜，第2天加入二抗孵育1 h，洗膜后暗室曝光、顯影。

1．3 統計學方法 采用SPSS16．0統計軟件。計量結果以±s表示，組間顯著性檢驗采用單因素方差分析。檢驗水準α=0．05。

2 結果

各組心肌細胞搏動頻率、凋亡率及RyR2蛋白表達見表1。

表1 各組心肌細胞搏動頻率、凋亡率及RyR2蛋白表達比較(ˉx ±s)

3 討論

慢性心力衰竭是絕大多數心血管疾病發展的最后階段，也是心血管疾病最常見的死亡原因。DOX是一種廣譜抗腫瘤藥，目前在臨床上廣泛用于治療白血病等各種惡性腫瘤，但其存在心肌毒性且有劑量依賴性，長期應用可致心肌功能障礙甚至心力衰竭［1］。心肌功能障礙的一個主要標志就是心肌收縮功能下降，而Ca2+循環可以看作是心肌收縮和舒張的調節器［4］。當心肌細胞除極時，少量Ca2+經L型通道進入細胞，觸發肌漿網通過RyR2將Ca2+釋放到胞質引起心肌細胞收縮。肌漿網鈣轉運異常引起心肌細胞內鈣超載及心肌損傷，導致心肌舒縮功能障礙，在心衰的病程中起重要作用。當心肌細胞中RyR2表達降低時，影響心肌的興奮—收縮耦聯，導致心肌收縮功能下降。研究發現，在心衰患者和動物中，RyR2的表達是下降的。因此鈣調控蛋白的表達在心功能改善中起著重要作用［5，6］。

大量臨床及實驗表明，他汀類藥物除具有降脂作用外，還有對心血管的多效性如抗氧化、抑制炎性反應、改善鈣調控蛋白的表達等［2］。研究表明，心衰大鼠中RyR2表達明顯下降，而給予SIM治療后，心衰大鼠心功能改善，RyR2表達顯著上升。Zheng等［7］發現，用SIM培養大鼠原代心肌細胞24 h后，RyR2蛋白表達水平明顯升高。但SIM是否通過改善鈣調控蛋白的表達，提高心肌的舒縮功能，以此來減輕DOX所致的心肌毒性尚未見文獻報道。本研究發現，DOX組及SIM低、中、高劑量組的心肌細胞搏動頻率、RyR2表達均明顯低于對照組，凋亡率均明顯高于對照組;SIM低、中、高劑量組的心肌細胞搏動頻率、RyR2表達均明顯高于DOX組，凋亡率均明顯低于DOX組，且呈劑量依賴性。提示SIM對DOX損傷乳鼠心肌細胞有保護作用，且呈劑量依賴性，其機制可能與提高RyR2表達有關。

［1］Outomuro D，Grana DR，Azzato F，et al．Adriamycin-induced myocardial toxicity:New solutions for an old problem［J］．Int J Cardiol，2007，11(7):6-15．

［2］Tousoulis D，Chacrakida M，Stefanadi E，et al．Statins in heart failure．Beyond the lipid lowering effect［J］．Intl J Cardio，2007，11(5):144-150．

［3］郭俊芳，張贏予，陳蓉，等．骨髓間充質干細胞旁分泌途徑與阿霉素損傷心肌細胞凋亡:怎樣證明其抑制效應［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2010，10(14):1755-1759．

［4］Gerd H，Burkert P．Calcium cycling in congestive heart failure［J］．Mol Cell Cardiol，2002，3(4):951-969．

［5］Shao QM，Ren B，Harjot K，et al．Sarcoplasmic reticulum Ca2+transport and gene expression in congestive heart failure are modified by imidapril treatment［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，28(8):1674-1682．

［6］Xu YJ，Chapman D，Dixon IM，et al．Differential gene expression in infarct scar and viable myocardium from rat heart following coronary ligation［J］．Cell Mol Med，2004，8(1):85-92．

［7］Zheng X，Hu SJ．Effects of simvastatin on cardiac performance and expression of sarcoplasmic reticular calcium regulatory proteins in rat heart［J］．Acta Pharmacologica Sinica，2005，26(6):696-704．