CREB特異性siRNA對人卵巢癌CAOV3細胞增殖的影響

葉麗平，馬靜方，楊春雨

(遼寧醫學院基礎學院，遼寧錦州121001)

卵巢癌是女性生殖系統常見惡性腫瘤之一，cAMP反應元件結合蛋白(CREB)在卵巢上皮細胞及顆粒細胞的生存中具有重要的作用［1］，與卵巢癌的發生、發展密切相關［2］。2010年4～7月，我們觀察了CREB特異性siRNA對人卵巢癌CAOV3細胞增殖的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1．1 材料 人卵巢癌CAOV3細胞系(武漢大學保藏中心);脂質體 2000、Trizol、MTT(Invitrogen)，CREB特異性siRNA由上海吉凱基因化學技術有限公司合成，兔抗人CREB、cyclin D1及β-actin(北京博奧森生物技術有限公司)，ECL試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)，RT-PCR試劑盒及引物(大連寶生物工程有限公司)。

1．2 實驗方法

1．2．1 細胞干預及增殖抑制率檢測 細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO2常規培養傳代。取對數生長期細胞接種于96孔板(1×104/孔)，每組設6個復孔隨機分成實驗組、陰性對照組和空白對照組。待細胞融合至40%～50%進行轉染。實驗組按照轉染試劑說明書分別轉染終濃度50、100、150 nM 的 CREB特異性 siRNA，陰性對照組轉染等體積的脂質體，空白對照組不予干預，終體積均為100 μl。4 h后常規換液培養至48 h，加入5 g/L滅菌的MTT溶液，DMSO呈色，570 nm處測量樣品的OD值。細胞增殖抑制率=1－(實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1．2．2 細胞干預及CREB、cyclin D1表達檢測 將細胞接種于6孔培養板(1×104/孔)，分組及轉染同前(終體積均為1 000 μl)，培養至48 h。Trizol法提取總RNA。cDNA合成條件:42℃反應30 min，99℃反應5 min，5℃反應5 min。PCR反應條件:94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環，循環結束后72℃延伸10 min。1．5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物。Western blot法檢測CREB、cyclin D1蛋白表達。Image J圖像分析軟件分析瓊脂糖凝膠及蛋白條帶的灰度值。以各組與β-actin灰度值的比值表示該組mRNA或蛋白的相對表達量。

1．3 統計學方法 采用SPSS16．0統計軟件，計量數據以±s表示，組間比較用t檢驗，多樣本比較用方差分析。檢驗水準α=0．05。

2 結果

細胞增殖抑制率及CREB、cyclin D1表達比較見表1。

3 討論

CREB是真核生物細胞的核內蛋白質，是調節轉錄的核因子。細胞胞外信號可與細胞膜上的受體相互作用，經過PKA、PKC、PKB、ERK等信號通路使CREB磷酸化并激活，在CREB結合蛋白及其他特異性轉錄因子的調控下，結合相關基因啟動區的CRE序列，提高CRE轉錄的活性，促進下游基因(如 c-fos、c-jun、BDNF、cyclin A、cyclin D)的轉錄及表達，進而調節細胞周期，促進細胞增殖、抑制凋亡等。多項研究表明，由CREB參與調控的靶基因在細胞增殖、分化、存活和細胞周期的調控中起重要作用。其過表達能促使細胞存活和增殖，在多種腫瘤的發生中具有重要作用［3～6］。

表1 各組增殖抑制率及CREB、cyclin D1表達比較(±s)

表1 各組增殖抑制率及CREB、cyclin D1表達比較(±s)

注:與陰性對照組比較，*P ＜0．05;與50 nM 比較，△P ＜0．05

組別 增殖抑制率(%) CREB mRNA CREB蛋白 cyclin D1 mRNA cyclin D1蛋白實驗組50 nM 18．9* 0．26 ±0．01* 0．35 ±0．02* 0．38 ±0．02* 0．49 ±0．02*100 nM 35．5＊△ 0．20 ±0．02＊△ 0．26 ±0．01＊△ 0．30 ±0．01＊△ 0．39 ±0．04＊△150 nM 34．4＊△ 0．21 ±0．03＊△ 0．25 ±0．03＊△ 0．30 ±0．03＊△ 0．40 ±0．03＊△空白對照組 0 0．33 ±0．03 0．42 ±0．03 0．46 ±0．04 0．57 ±0．07陰性對照組1．1 0．33 ±0．04 0．43 ±0．03 0．45 ±0．05 0．56 ±0．05

研究證實，CREB表達水平及磷酸化程度在卵巢上皮細胞及顆粒細胞的生存中具有重要作用，卵泡刺激素和黃體生成素至少部分是通過cAMP細胞內信號通路調節卵巢的功能。Somers等［7］發現，CREB的ser133突變成Ala133，將不能被磷酸化激活，可明顯抑制鼠卵巢顆粒細胞生存。說明CREB是促進卵巢生存的重要蛋白，在卵巢癌的發生發展過程中起重要作用［8］。腫瘤的發生發展不僅僅是癌基因的活化與抑癌基因的失活，還與凋亡相關基因的異常表達及生長因子過量表達、細胞周期失控有關。多數組織細胞發生惡性轉化后，細胞周期縮短，增殖加快。目前，通過調節腫瘤細胞的周期變化，誘導其分化為正常或接近正常的細胞，從而抑制其無限制的增殖，已成為臨床腫瘤療和研究的全方向［9］。本研究發現，CREB特異性siRNA轉染48 h后，可明顯抑制細胞增殖，說明CREB參與調控腫瘤細胞的生長與增殖;CREB、cyclin D1的mRNA及蛋白表達顯著降低，提示CREB可能參與調控cyclin D1的表達，與卵巢癌的發生發展密切相關，可能成為腫瘤治療的新靶點。

總之，CREB特異性siRNA可有效抑制人卵巢癌CAOV3細胞增殖，其機制可能與CREB和cyclin D1的表達降低有關。

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