pEFNB2-shRNA載體對人宮頸癌Hela細胞EFNB2表達、增殖及凋亡的影響

謝秋群，唐雄志，羅兆芹，楊 煒，彭廣濤

(桂林市人民醫院，廣西桂林541002)

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，近年來其具有年輕化趨勢。2008年5月～2009年7月，我們觀察了 pEFNB2-shRNA載體對人宮頸癌 Hela細胞EFNB2表達、增殖及凋亡的影響，初步研究其對宮頸癌侵襲轉移生物學功能的影響，為其臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 人宮頸癌Hela細胞株，DMEM培養液、Lipo2000TM，線型載體 pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector、DH5α由本實驗室保存;T4 DNA連接酶，限制性內切酶;DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)，抗人ephrinB2抗體，小牛血清，其余試劑購自進口或國產。PCR引物合成和DNA測序由Invitrogen公司完成。

1．2 實驗方法

1．2．1 pEFNB2-shRNA載體構建 根據 GenBank提供的EFNB2的mRNA全序列，采用Ambion公司的siRNA在線設計工具，選取2條21nt的序列:序列1(CCAGGAATAAAGATCCAACAA)、序列2(CTGGTACTATACCCACAGATA)，通過BLAST軟件確定與其他非相關基因無同源性，合成相應的shRNA正義鏈及其互補鏈，兩端包含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點及反向互補靶序列，被非同源序列(CTCGAG)隔開，3’末端加有TTTTTT終止序列。由Invitrogen公司合成，將得到的片段命名為EFNB2-shRNA1、EFNB2-shRNA2。與 pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector連接后，以其為模板，采用PCR方法擴增出帶有U6啟動子的shRNA表達框，經測序正確，分別用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切插入pEGFP-C1質粒，經電泳回收、純化和轉化后，挑取陽性菌落擴大培養后，抽提質粒DNA，經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定正確者送Invitrogen公司測序。

1．2．2 細胞培養及轉染 取對數生長期的宮頸癌Hela細胞，以細胞數2×105/孔，接種于6孔板，待細胞生長至70%融合時，將兩種構建的pEFNB2-shRNA載體和pEGFP-C1空質粒分別轉染Hela細胞，并相應標記為實驗組和對照組，未轉染任何質粒的標記為空白組。按Invitrogen公司提供的 Lipo2000TM脂質體轉染操作手冊進行細胞轉染。48 h后加入500 mg/L的G418進行篩選，并挑選穩定克隆進行鑒定，具明顯沉默效應者轉入培養瓶中擴大培養。

1．2．3 EFNB2 mRNA表達及EFNB2蛋白檢測 收集轉染48 h的各組細胞。采用RT-PCR檢測各組EFNB2 mRNA表達:應用Trizol試劑抽提轉染細胞總RNA，反轉錄為cDNA，PCR擴增，同時擴增β-actin作為內參照，PCR產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察各組EFNB2 mRNA的表達情況并拍照。EFNB2反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55．5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環，72℃延伸10 min。β-actin反應條件:94℃變性4 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環，72 ℃ 延伸 10 min。Western blot法檢測各組EFNB2蛋白表達:蛋白經SDS-PAGE 60V電泳1．5 h后轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶37℃封閉1 h，一抗(1∶500)4℃過夜，相應二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h，顯影定影液成像，同時檢測β-actin(1∶500)的表達作為內參照。RT-PCR和Western blot檢測結果用Uvp grabit Imagel軟件采集，Gelworks 1D Advanced V4．01軟件處理分析，計算各條帶的積分吸光度(IA)，采用目的條帶與βactin的IA比值表示EFNB2含量。

1．2．4 細胞生存率檢測 采用MTT法。將Hela細胞按3×103個/孔接種于96孔板，按上述分組及轉染方法，每組設6個復孔，于轉染后12、24、48、72、96 h 分別加入10 mg/ml MTT 液10 μl，繼續培養4 h后平板離心，棄上清，每孔加入DMSO 150 μl振蕩溶解30 min，酶標儀測定各孔波長為570 nm的A值，計算各組A570平均值，按如下公式計算細胞生存率。細胞生存率=A實驗孔/A對照孔×100%

1．2．5 細胞凋亡率檢測 將Hela細胞接種無菌6孔板，按上述分組及轉染方法，收取不同處理方式作用24、48 h后的各組細胞，PBS洗滌，調整細胞濃度為1×106個/ml，75%乙醇 －20℃過夜固定，檢測前PBS洗滌1次，1 500 r/min離心5 min，加入含0．1%RNA 酶和 10 μg/ml PI的染色液 500 μl，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并計算細胞凋亡率。

1．3 統計學方法 采用SPSS12．0統計軟件，計量數據用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準 α =0．05。

2 結果

2．1 EFNB2 mRNA及蛋白表達 見表1。

表1 各組EFNB2 mRNA及EFNB2蛋白表達(±s)

表1 各組EFNB2 mRNA及EFNB2蛋白表達(±s)

注:與對照組和空白組比較，*P＜0．05

組別 EFNB2 mRNA EFNB2蛋白實驗組 0．16 ±0．04* 0．23 ±0．08*對照組 0．83 ±0．07 0．75 ±0．05空白組0．87 ±0．05 0．78 ±0．06

2．2 細胞增殖率 見表2。

表2 各組細胞生存率比較(%)

2．3 細胞凋亡率 見表3。

3 討論

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，其治療原則為早期以手術為主、輔以放化療;晚期以放療為主，輔以化療。對于喪失手術機會的患者，基因治療被認為是最有前途的方法之一［1］。RNAi是一種高效的特異性強的基因阻斷技術，近年成為功能基因組研究的有力工具。同時，由于RNAi技術特異性高，作用迅速，不良反應小，在有效地沉默靶基因的同時，對細胞本身的調控系統無明顯影響，是目前基因治療研究的熱點，其高效的序列特異性基因剔除技術在遺傳性疾病和惡性腫瘤基因治療領域發展極為迅速，為治療遺傳病、癌癥等疾病開辟了新的途徑。

表3 各組細胞凋亡率比較(%)

EFNB2基因定位于人類3號染色體q33，編碼ephrinB2蛋白，是目前已知的酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的一個亞家族Eph/ephrin家族成員之一。研究發現，人類的許多生物學功能和病理過程都與Ephs/ephrins有關，包括血管形成、神經軸突導向、組織塑型、腫瘤生成等。其中EphB4/ephrinB2信號通路因其高度的血管生成特異性及與腫瘤侵襲、轉移的相關性而成為醫學專家關注的焦點［2，3］。大量研究顯示，若抑制腫瘤細胞EphB4的表達，可明顯減少腫瘤細胞的增殖、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲和轉移［4］。由于ephrinB2是EphB4的特異性配體，且都為跨膜蛋白，EphB4/ephrinB2信號通路的激活需依賴細胞間接觸，而且信號傳導是雙向的，一般認為 ephrinB2激活 EphB4為正向信號，而EphB4激活ephrinB2為逆向信號，逆向信號經ephrinB2+細胞傳導可促進腫瘤發展［5］。研究發現，EphB4/ephrinB2與婦科腫瘤的發生密切相關，EphB4和ephrinB2在宮頸癌細胞中表達明顯增強，提示EphB4和ephrinB2在宮頸癌發生及血管生成中起重要作用［6］;干擾EphB4表達可明顯減少腫瘤細胞增殖，誘導凋亡，抑制其侵襲和轉移［7］。本研究pEFNB2-shRNA組EFNB2 mRNA、蛋白水平均明顯低于對照組和空白組;細胞凋亡率明顯高于對照組，生存率明顯低于對照組。pEFNB2-shRNA載體能有效抑制細胞EFNB2基因表達，并可能通過干擾細胞ephrinB2表達而阻斷逆向信號的傳導，進而抑制細胞增殖，促進其凋亡。

總之，pEFNB2-shRNA載體能降低Hela細胞的增殖活性，促進其凋亡，其機制可能為抑制EFNB2基因表達。pEFNB2-shRNA載體的成功構建為進一步研究EFNB2基因的生物學功能提供了有力的工具。

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