LPSp聯合HBsAg對孕鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-6水平的影響

覃曉慧，黃 星*，冷 靜，王啟輝，陳 悅，龐麗紅

(1廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021;2廣西醫科大學免疫教研室)

機體內乙型肝炎病毒(HBV)清除與Th1、Th2型細胞因子有關，細胞因子的不平衡應答可導致乙型肝炎慢性化。在機體HBV病毒清除過程中，細胞免疫發揮主要作用［1］。因此，阻斷HBV宮內感染的方向應重點著手于如何提高母體的特異性細胞免疫應答。2010年10月～2011年7月，我們觀察了革蘭氏陰性非致病成團泛菌脂多糖(LPSp)聯合乙肝表面抗原(HBsAg)對孕鼠血清 IFN-γ、IL-4、IL-6水平的影響，旨在為其用于HBV宮內感染的治療提供依據。

1 材料與方法

1．1 材料 昆明小鼠75只，其中雌性50只，雄性25只;7～9周齡，體質量30～35 g，購于廣西醫科大學動物實驗中心。50只孕鼠共產胎鼠368只。LPSp從日本德島文理大學健康科學研究所贈送的成團泛菌中提取純化，由廣西醫科大學微生物學與免疫學教研室免疫學研究室制備保存，質量濃度為2 mg/ml。HBsAg購于深圳康泰生物制品股份有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 動物分組及干預 50只孕鼠(按雌雄2∶1的比例，合籠后第2天看孕栓，發現孕栓者另籠飼養并記為孕0 d)隨機分為5組各10只，于孕期的第1天和第14天，分別于左下肢脛前肌注藥物，聯合低劑量組肌注 HBsAg 100 μl+LPSp 5 μl，聯合中劑量組肌注 HBsAg 100 μl+LPSp 15 μl，聯合高劑量組肌注 HBsAg 100 μl+LPSp 25 μl，HBsAg 組肌注 HB-sAg 100 μl，對照組肌注生理鹽水 100 μl。

1．2．2 觀察項目 ①胎鼠身長、體質量、胎腦重量:孕20 d測量。②血清 IFN-γ、IL-4、IL-6水平:至孕20 d給孕鼠眼球靜脈取血，分離血清，－80℃保存備用。采用ELISA法，實驗步驟按試劑盒說明書進行操作。

1．3 統計學方法 采用SPSS16．0統計軟件。計量數據用±s表示，各組均數的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，相關性采用Pearson相關分析。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 胎鼠身長、體質量、胎腦重量 見表1。由表1可見，各組胎鼠體質量、身長及胎腦重比較均無統計學差異。

表1 各組胎鼠身長、體質量、胎腦重量比較(±s)

表1 各組胎鼠身長、體質量、胎腦重量比較(±s)

組別 n 身長(cm) 體質量(g) 胎腦重量(g)聯合低劑量組77 2．76 ±0．24 1．59 ±0．26 0．062 ±0．009聯合中劑量組 72 2．74 ±0．30 1．54 ±0．50 0．060 ±0．010聯合高劑量組 74 2．73 ±0．27 1．52 ±0．27 0．059 ±0．009 HBsAg 組 70 2．81 ±0．21 1．65 ±0．18 0．063 ±0．004對照組75 2．85 ±0．36 1．66 ±0．28 0．062 ±0．008

2．2 孕鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-6水平 見表2。

表2 各組孕鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-6水平比較(n=10，pg/ml，ˉx ± s)

3 討論

輔助性T淋巴細胞(Th)是CD+4T細胞，根據分泌細胞因子的不同，分Th1和 Th2細胞，IFN-γ是Th1細胞分泌的特征性細胞因子，具有促進Th1細胞分化，上調Th1型免疫反應對病毒抑制與清除的作用。在乙肝病毒的清除過程中機體主要通過細胞因子IFN-γ介導非溶細胞途徑清除乙肝病毒［2］。而IL-4、IL-6是Th2細胞分泌，是Th2細胞應答強度的重要衡量指標。當機體處于正常狀態時，Th1/Th2型細胞因子互為制約，處于動態平衡，維持正常的細胞免疫和體液免疫功能，一旦這種動態平衡打破將導致疾病發生及發展［3］。采用含HBsAg的疫苗預防和治療乙型肝炎是近年研究熱點，HBsAg能誘導有效的體液免疫反應［4］，而目前廣泛應用的鋁佐劑僅能增強Th2類免疫反應，對Th1類反應有抑制作用。因此，在乙型肝炎疫苗的研發中如能使抗原特異性向Th1方向分化并產生有效的細胞毒性淋巴細胞反應，對于預防和治療HBV感染具有重要的意義［5］。妊娠時，孕婦的免疫功能在一定程度上受到抑制，對疫苗的反應也較低下。劉海英等［6］發現，HBV宮內感染與未發生感染的孕婦比較，IFN-γ顯著降低，而IL-6顯著增高，即發生HBV宮內感染的孕婦存在Th2型細胞免疫反應增強而Th1型細胞免疫下調，認為孕婦Th1/Th2細胞免疫失衡可能是導致HBV宮內感染的重要因素。梅燕等［7］認為，乙肝孕婦血清IL-4、IL-6水平升高，抑制IFN-γ表達，而孕婦體內IFN-γ低下，其抗病毒能力減弱，HBV復制活躍。

LPSp是從小麥粉中分離出的革蘭陰性非致病菌成團泛菌中進行分離純化的相對分子質量僅為5 000的低分子脂多糖。Leng等［8］將其作為乙肝表面抗原佐劑用于小鼠，發現其對小鼠HBs抗體的產生具有增強作用。本研究聯合各劑量組IFN-γ、IL-4、IL-6水平均明顯高于HBsAg組及對照組，且呈濃度依賴性;HBsAg組IFN-γ水平明顯低于對照組，IL-4、IL-6水平明顯高于對照組，其原因可能是高劑量的LPSp主要增強Th1細胞反應，對Th2細胞反應無明顯增強作用。提示LPSp對孕鼠Th1/Th2的調節呈劑量依賴性，高劑量LPSp可使IFN-γ反應增強，而低劑量LPSp可使IL-4、IL-6反應增強。本研究還發現，LPSp對胎鼠身長、體質量、胎腦重量均無影響，提示其應用較為安全。

綜上所述，高劑量LPSp可增強孕鼠Th1型細胞因子反應，而低劑量LPSp可增強Th2型細胞因子反應。LPSp能否調節HBV感染孕婦Th1/Th2細胞因子平衡紊亂，從而阻斷乙肝病毒宮內感染將是我們今后研究的重點。

［1］Robek MD，Garcia ML，Boyd BS，et al．Role of immunoproteasome catalytic subuntis in the immune response to hepatitis B virus［J］．Virol，2007，81(2):483-491．

［2］Wieland SF，Eustaquio A，Whitten-Bauer C，et al．Interferon prevents formation of replication-competent hepatitis B virus RNA-containing nucleocapsids［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(28):9931-9917．

［3］趙武述．免疫平衡的研究及其臨床意義［M］．北京:科學出版社，2005:127-137．

［4］Wang S，Liu X，Caulfield MJ．Adjuwant synergy in the response to hepatitis B vaccines［J］．Vaccine，2003，21(2730):4297-4306．

［5］Liu L，Zhou X，Liu H，et al．CPG motif acts as a-danger signal and provides a Thelper type2 biased microenvironment for DNA vaccination［J］．Immunology，2005，115(2):223-230．

［6］劉海英，單瑞芹，李曉梅，等．乙型肝炎病毒母嬰垂直傳播與Th1/Th2型細胞因子相關性研究［J］．實用婦產科雜志，2003，19(4):230-232．

［7］梅燕，黃星．乙型肝炎病毒宮內感染與IFN-γ和IL-4、IL-6細胞因子的相關性［J］．中國優生與遺傳雜志，2007，15(10):37-38．

［8］Leng J，Wang QH，Wang J，et al．The regulatory effect of LPSp on hepatitis B surface antibody［J］．Chin J Chro Dis，2004，3(4):84-88．