乳腺癌組織中Livin表達及臨床意義

陳 駿，何志賢，王 華*

(1南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院，江蘇南通226001;2南通大學(xué)附屬醫(yī)院)

乳腺癌是一種常見惡性腫瘤，其不僅與原癌基因的激活及抑癌基因的失活有關(guān)，也與細胞凋亡的失控密切相關(guān)。2005年5月～2011年5月，我們檢測了乳腺癌組織中存活蛋白(Livin)的表達，現(xiàn)探討其臨床意義。

1 材料與方法

1．1 材料 選擇南通大學(xué)附屬醫(yī)院及我院手術(shù)切除的乳腺癌組織標(biāo)本80份(乳腺癌組)，患者均為女性，年齡(44±15．4)歲。均未行輔助放化療，且經(jīng)病理證實。腫瘤直徑＜2 cm 36例，≥2 cm 44例;組織學(xué)分級Ⅰ級25例，Ⅱ級25例，Ⅲ級30例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例;臨床分期Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期35例;ER陽性32例，PR陽性31例，HER-2陽性26例。另選同期手術(shù)切除的乳腺纖維腺瘤組織標(biāo)本10份(纖維腺瘤組)及正常乳腺組織標(biāo)本10份(正常組)，各組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異。主要試劑及儀器:兔抗人Livin受體抗體(BAO1743，武漢博士德生物公司)，免疫組化試劑盒及DAB顯色液(Biotin公司)，HER-2、激素受體(ER、PR)由南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科常規(guī)免疫組化提供;透射電子顯微鏡(JEM-1230，日本 JEOL公司)。

1．2 Livin表達檢測 標(biāo)本離體后立即切塊固定，固定液［4%多聚甲醛0．1 mol/L PBS(pH 7．2～7．6)］含有1/1 000 DEPC，固定2 ～4 h，制成石蠟切片。采用免疫組化SP法行Livin檢測，按試劑說明書操作。由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師以雙盲法閱片，免疫組織化學(xué)染色顯示，Livin主要表達于細胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或棕褐色。結(jié)果判斷采用半定量積分法，每份切片積分=陽性細胞染色程度+陽性細胞率。染色陰性為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分;陽性細胞率0～5%、6% ～50%、＞50%分別計1、2、3分。兩項評分之和＜3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，＞6分為強陽性(+++)。

1．3 細胞形態(tài)學(xué)觀察 標(biāo)本離體后立即用雙面刀片將其切成數(shù)個1 mm3組織塊，投入預(yù)冷的4%戊二醛溶液中，放4℃冰箱內(nèi)后固定2 h以上，分別按漂洗、固定、脫水、浸透、包埋，修塊、半薄切片定位、超薄切片以及電子染色后，按低中高表達應(yīng)用JEOL-1230透射電子顯微鏡(TEM)觀察細胞凋亡情況并攝片。

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15．0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用 t檢驗，定性資料采用 χ2檢驗，Spearman等級相關(guān)分析法分析Livin的陽性表達與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，應(yīng)用Log-rank分析Livin表達與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 Livin表達 乳腺癌組、纖維腺瘤組及正常組Livin陽性表達率分別為75%、10%、0，乳腺癌組明顯高于纖維腺瘤組及正常組，P均＜0．05。

2．2 Livin表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 Livin表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2．3 細胞形態(tài)變化 Livin低表達者(11例)細胞呈長橢圓形，癌細胞核異染色質(zhì)成分較少，核大、形態(tài)相對規(guī)則呈高分化狀態(tài);癌細胞間連接緊密，胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體等細胞器。中表達者(38例)腫瘤細胞增生、排列紊亂，胞體體積較大;核大，形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)可見有不同程度的腫脹線粒體，間質(zhì)成分少，凋亡細胞超微結(jié)構(gòu)改變及凋亡細胞形態(tài)特征及凋亡細胞數(shù)量介于第一組和第二組之間。高表達者(31例)細胞核大而畸形，胞質(zhì)內(nèi)較多粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及有不同程度的腫脹、空泡化的線粒體;核大呈不規(guī)則形，核漿比例增高呈低分化狀態(tài)。

2．4 Livin表達與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后均隨訪5 a。Livin陰性表達和低表達(－～+)者5年生存率為75．7%(28/37);高表達(++～+++)者5年生存率為58．1%(25/43);高表達者5年生存率明顯低于陰性表達和低表達者(P＜0．05)。

3 討論

Livin是最近發(fā)現(xiàn)的IAPs蛋白家族新成員，目前報道其只在黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺腺癌、膀胱癌和神經(jīng)母細胞瘤等及胎盤、胚胎組織中表達，在多數(shù)正常組織中不表達［1，2］。國內(nèi) Livin在乳腺癌中的表達報道較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組Livin表達明顯高于纖維腺瘤組及正常組，與國外文獻報道基本一致［3］，說明Livin基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，進而驗證了乳腺癌發(fā)生過程中多步驟、漸進性的特點。本研究還發(fā)現(xiàn)，Livin表達與乳腺癌患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，提示臨床分期越晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)越多、年齡越小，其Livin的表達越強。

Liang等［4］、李凡等［5］和 Wang 等［6］分別采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)構(gòu)建了Livin特異性siRNA真核表達載體，并成功篩選出穩(wěn)定沉默Livin基因的乳腺癌、胃癌細胞株，觀察分析Livin基因被抑制后腫瘤細胞生物學(xué)行為的變化。各實驗發(fā)現(xiàn)沉默Livin后，細胞自發(fā)的凋亡增加，癌細胞的增殖能力減弱，提示Livin有可能成為腫瘤凋亡誘導(dǎo)治療的新靶點。本研究通過透射電鏡的方法觀察到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)增多，Livin陽性率升高。Livin高表達者的細胞超微結(jié)構(gòu)凋亡細胞形態(tài)異常程度明顯高于中低表達者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)越多;Livin表達陽性率越高，腫瘤細胞分化越差，腫瘤惡性程度越高;Livin高表達者5年生存率明顯低于陰性表達和低表達者，提示Livin高表達者預(yù)后較差，有較高的復(fù)發(fā)率及低生存率。

總之，Livin可促進乳腺癌細胞增殖，其可作為乳腺癌診斷及預(yù)后判斷新的分子標(biāo)記物及乳腺癌誘導(dǎo)凋亡治療的新靶點。

［1］Lazar I，Yaacov B，Shiloach T，et al．The oncolytic activity of Newcastle disease virus NDV-HUJ on chemoresistant primary melanoma cells is dependent on the proapoptotic activity of the inhibitor of apoptosis protein Livin［J］．J Virol，2010，84(1):639-646．

［2］Cai M，Wang GB，Tao KX，et al．Apoptosis induction effect of siRNA recombinant expression vector targeting Livin and Survivin gene simultaneously on human colon cancer cells［J］．Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi，2009，12(4):399-403．

［3］Piura E，Piura B．Autoantibodies to tailor-made panels of tumor-associated antigens in breast carcinoma［M］．J Oncol，2011:982425．

［4］Liang CY，Ma P．Effect of RNAi-mediated gene silencing of Livin on apoptosis of human breast cancer cell line ZR-75-30［J］．Chin J Cancer Res，2008，20(2):100-104．

［5］李凡，王小毅，陳力，等．Livin靶向RNA干擾對MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的響［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，30(24):2302-2306．

［6］Wang TS，Ding QQ，Guo RH，et al．Expression of Livin in gastric cancer and induction of apoptosis in SGC-7901 cells by shRNA-mediated silencing of Livin gene［J］．Biomedi Pharmacother，2010，64(5):321-330．