BRMS1基因在胃癌中的表達(dá)及意義

韓國(guó)新，魏立偉，王慶寶

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東泰安271000)

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因是目前腫瘤臨床防治研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)，乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因(BRMS1)與多種惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胃癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，本研究旨在探討B(tài)RMS1基因在胃癌中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2005年1月～2006年11月泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的胃癌患者44例，男26例、女18例，年齡19～73歲、中位年齡52．3歲。患者術(shù)前均未經(jīng)化療或放療等其他治療。在手術(shù)時(shí)收集標(biāo)本，用DEPC處理過(guò)的生理鹽水將血液洗凈，立即置于液氮中，24 h后貯存在－80℃冰箱。術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)，另取距腫瘤邊緣5 cm以上胃組織(術(shù)后病理未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn))作為對(duì)照。

1．2 BRMS1的檢測(cè) RNA的提取:取100～200 mg胃癌組織及癌旁正常胃組織分別在不同的研缽中經(jīng)液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至1．5 ml EP管中，提取總RNA(總RNA分離試劑盒，華美生物工程公司);RNA 逆轉(zhuǎn)錄:體系為:RNA 2 μl、ARP(0．5 μg/μl)1 μl、0．1%DEPC 水 9 μl，輕度離心混勻，70 ℃5 min;0℃ 5 min;冰水中加反應(yīng)液5×buffer緩沖液5 μl，dNTPs(2．5 mmol)4 μl，RNase 抑制劑 1 μl，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 2 μl，0．1%DEPC 水 1 μl，反應(yīng)總體積25 μl，混勻后，37 ℃ 60 min;70 ℃ 10 min;將反應(yīng)生成的cDNA存于－20℃冰箱備用。PCR反應(yīng):以cDNA為模板進(jìn)行目的基因及內(nèi)參18 s rRNA產(chǎn)物擴(kuò)增，注意每組實(shí)驗(yàn)均常規(guī)設(shè)置復(fù)管和陰性對(duì)照。目的基因引物及內(nèi)參引物由大連TAKARA公司設(shè)計(jì)合成并且經(jīng)GenBank驗(yàn)證序列。BRMS1基因特異性引物，上游5'-ATGCCTGTCCAGCCTCCAAG-3';下游 5'-GCGTCGCTCATAGTCCTCATCA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度168 bp。18 s rRNA特異性引物，上游5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3';下游5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度151 bp。PCR反應(yīng)體系:10 × buffer緩沖液 5 μl，MgCl2溶液(25 mmol/L)3 μl，dNTPs(各 2．5 mmol/L)4 μl，上游引物 (10 μmol/L)1 μl，下游引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 1 μl，rTaq 酶(5 U/μl)0．5 μl，ddH2O 34．5 μl，總體積為50 μl。內(nèi)參18 s rRNA反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，進(jìn)行20個(gè)循環(huán);72℃延伸4 min。BRMS1基因反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán);72℃延伸4 min。瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像分析系統(tǒng)圖像處理:取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μl的6×buffer上樣緩沖液充分混合后，加入凝膠電泳孔中，并用5 μl Mark 2000作為標(biāo)記，在120 V、50 mA條件下進(jìn)行電泳。凝膠分析，采用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描分析，測(cè)定電泳條帶的光密度值。

結(jié)果判斷:BRMS1的表達(dá):以看到清晰的條帶作為有表達(dá)，記為“+”;沒(méi)有表達(dá)記為“－”。BRMS1相對(duì)表達(dá)水平:測(cè)定BRMS1 mRNA在胃癌組織及癌旁正常胃組織中表達(dá)的光密度值，與同一標(biāo)本的內(nèi)參照18 s rRNA電泳條帶的光密度值相比。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12．0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)比較行χ2檢驗(yàn)、校正χ2檢驗(yàn)、Fisher精確概率分析檢驗(yàn)。P≤0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 BRMS1 mRNA在胃癌組織中的表達(dá) 胃癌組織中 BRMS1表達(dá)陽(yáng)性14例，表達(dá)量為0．21±0．19，陰性30例;正常胃癌組織分別為35例、0．96±0．21、9例。胃癌組織BRMS1的表達(dá)量低于正常胃組織(P ＜0．01)。

2．2 BRMS1 mRNA與胃癌組織臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 BRMS1 mRNA與胃癌組織臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系(例)

3 討論

BRMS1系2000年 Seraj等［1］運(yùn)用差異顯示分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)的定位于人染色體11q13．1～q13．2的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，全長(zhǎng)為10 kb，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成。cDNA全長(zhǎng)1 485 bp，有1個(gè)741 bp的長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(核苷酸122～862)。編碼1個(gè)有264個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量為28 500。BRMS1基因在被檢測(cè)的酵母、小鼠、人等多個(gè)物種及胰腺、胸腺、脾等多種人正常組織中均有不同程度的表達(dá)。而且人BRMS1與鼠BRMS1 cDNA 85%同源，蛋白序列同源性達(dá)95%，顯示出較高的序列保守性［2］，提示該基因具有重要的生物學(xué)功能。

BRMS1抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制包括，恢復(fù)縫隙連接的細(xì)胞間信息交流，促進(jìn)失巢凋亡，抑制在軟瓊脂中的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移/侵襲［3］。在分子水平上，當(dāng)BRMS1重新表達(dá)時(shí)，可改變轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，包括表皮生長(zhǎng)因子受體、骨橋蛋白、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、C-X-C趨化因子受體4和成束蛋白。此外BRMS1也可調(diào)控miRNA在內(nèi)的非編碼基因，可協(xié)同調(diào)節(jié)多個(gè)metastamiR的表達(dá)［4］。

BRMS1基因?qū)θ橄侔┑霓D(zhuǎn)移抑制作用已為大部分學(xué)者所共識(shí)，一系列研究發(fā)現(xiàn)它的轉(zhuǎn)移抑制作用不只存在于乳腺癌中，而且在惡性黑色素瘤、膀胱癌、卵巢上皮癌、子宮內(nèi)膜癌、口腔鱗癌、喉癌、小細(xì)胞未分化肺癌等多種腫瘤轉(zhuǎn)移中均起抑制作用，表現(xiàn)為惡性腫瘤伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，BRMS1 mRNA表達(dá)下降或缺失，并且轉(zhuǎn)染BRMS1的癌細(xì)胞株，其轉(zhuǎn)移潛能明顯降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BRMS1 mRNA在胃癌中的表達(dá)水平較正常胃組織明顯降低或表達(dá)缺失，而且與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表現(xiàn)為隨胃癌分化程度減低、浸潤(rùn)深度的增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，BRMS1 mRNA表達(dá)下調(diào)或缺失。但BRMS1 mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、胃癌的組織分型無(wú)明顯關(guān)系。而彭海等認(rèn)為BRMS1 mRNA的表達(dá)下降能夠促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可以作為臨床預(yù)測(cè)胃癌轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。同時(shí)發(fā)現(xiàn)BRMS1 mRNA的表達(dá)與胃癌的病理類型和分化程度無(wú)關(guān)。本研究與此研究結(jié)果基本一致，但在與腫瘤的分化程度上存在差異，考慮BRMS1 mRNA具有不同長(zhǎng)度的變異剪切體，如果使用不同的PCR引物檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。由此提示BRMS1基因?qū)ξ赴┑霓D(zhuǎn)移也具有抑制作用，可望成為胃癌轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)標(biāo)志之一。

［1］Seraj MJ，Samant RS，Verderame MF，et al．Functional evidence for a novel human breast carcinoma metastasis suppressor，BRMS1，encoded at chromosome 11q13［J］．Cancer Res，2000，60(11):2764-2769．

［2］Samant RS，Debies MT，Shevde LA，et al．Identification and characterization of the murina ortholog(brms1)of breast-cancer metastasis suppressor 1(BRMS1)［J］．Int J Cancer，2002，97(1):15-20．

［3］Edmonds MD，Hurst DR，Welch DR．Linking metastasis suppression with metastamiR regulation［J］．Cell Cycle，2009，8(17):2673-2675．

［4］Edmonds MD，Hurst DR，Vaidya KS，et al．Breast cancer metastasis suppressor 1 coordinately regulates metastasis-associated microRNA expression［J］．Int J Cancer，2009，125(8):1778-1785．