RELN基因單核甘酸多態性與兒童孤獨癥臨床特征的相關分析

孫穎，盛昭明，劉明遠，楊利敏，李興洲，姜志梅

兒童孤獨癥是一種較為嚴重的發育障礙性疾病，多于3歲前發病，男孩比女孩多見。它的基本特征是不同程度的言語發育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板。孤獨癥的病因涉及環境和遺傳因素，家系研究和雙生子研究證實遺傳因素在孤獨癥發病中起關鍵的作用。

RELN基因定位在孤獨癥的易感基因座位7q22，編碼的reelin蛋白在與腦發育相關的神經元遷移和定位過程發揮重要作用。國外已進行許多該基因與孤獨癥的關聯研究，但有關研究得出的結論不一。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2006年1月～2007年12月佳木斯大學附屬第三醫院發育與行為兒科收治孤獨癥患兒30例，均為漢族，其中男性24例，女性6例；年齡3～12歲。同期選取佳木斯幼兒園和小學的健康兒童30例為對照組，其中男性24例，女性6例；年齡3～12歲。兩組兒童性別及年齡無顯著性差異(P＞0.05)。

1.2 診斷標準 所有患兒符合美國《精神障礙診斷和統計手冊》第4版(DSM-Ⅳ)規定的兒童孤獨癥的診斷標準[2]。

1.3 納入標準

1.3.1 病例組 ①年齡3～12歲漢族兒童；②完全符合兒童孤獨癥的診斷標準；③孤獨癥兒童行為檢查量表(Autism Behavior Checklist，ABC)評分≥67分；兒童孤獨癥評定量表(CARS)評分≥30分；④家長知情同意。

1.3.2 對照組 ①年齡3～12歲，與相應匹配的病例組兒童的年齡相差不超過0.5歲；②與病例組相應匹配兒童的性別相同；③漢族；④孕期及出生時正常；⑤與病例組兒童無血緣關系；⑥家長知情同意。

1.4 排除標準 全面體格檢查和神經精神檢查后認為該名兒童可能存在已知病因的發育障礙或其他神經精神疾病，包括精神發育遲滯、其他廣泛性發育障礙。

1.5 檢測方法 每名研究對象抽取靜脈血2 ml置于EDTA抗凝管內，搖勻后立即－20℃凍存。使用DNA提取試劑盒提取DNA。

RELN基因exon 6 SNP的基因分型采用聚合酶鏈式反應技術。PCR引物如下：

正向5′-ACA GCA TGT TGG CAC TTG TG-3′反向5′-TTG GTG GTA GGA GTC AAA GT-3′

用大連寶生物公司的TaKaRa TaqTM試劑盒擴增。PCR反應液共25 μl，內含基因組DNA、引物、Taq酶、緩沖液、dNTPs。PCR條件：95℃預變性10 min，繼以94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，72℃終末延伸8 min。經PCR儀擴增后產物為135 bp，由內切酶PvuⅡ酶切后產生79 bp和56 bp兩個片斷，組成3種基因型：A/A（135 bp/135 bp），A/G（135 bp/79 bp/56 bp），G/G（79 bp/56 bp）。

1.6 統計學方法 應用統計分析軟件SPSS 11.5計算不同基因型在不同組間的分布情況。

2 結果

2.1 RELN基因exon 6 SNP基因型分布 A等位基因PCR產物不含PvuⅡ酶切位點，只有一個長度為135 bp的片段。G等位基因PCR產物含PvuⅡ酶切位點，酶切后產生長度分別為79 bp和56 bp的片段。根據電泳結果，exon 6 SNP A/A基因型為一條長135 bp的條帶，A/G基因型為3條長度為135 bp、79 bp和56 bp的條帶，G/G基因型為兩條長79 bp和56 bp的條帶（圖1）。

2.2 基因型和等位基因頻率 χ2檢驗顯示基因型及等位基因頻率分布符合H-W平衡法則。兒童孤獨癥組與對照組exon 6 SNP基因型和等位基因頻率存在顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

圖1 exon 6 SNP基因型分型電泳圖

表1 兩組exon6 SNP基因型與等位基因頻率

2.3 基因型與臨床特征的關系 單因素方差分析顯示，不同基因型孤獨癥兒童ABC總分及交往因子得分存在非常顯著性差異（P＜0.01)；經進一步LSD分析，在基因型為A/A和A/G、A/A和G/G孤獨癥兒童之間，交往因子存在顯著性差異(P＜0.05)，基因型為A/G和G/G之間ABC總分存在顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

2.4 病情嚴重程度與exon 6 SNP的關系 重度與輕中度孤獨癥組exon 6 SNP基因型及等位基因分布存在顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

2.5 不同基因型兒童CARS得分的比較 單因素方差分析顯示，不同基因型的孤獨癥兒童模仿、聽覺反應、非語言和總分存在顯著性差異(P＜0.05)；LSD分析，在基因型為A/A、G/G的孤獨癥兒童之間在模仿、聽覺反應和CARS總分存在顯著性差異(P＜0.05)；在基因型為A/A和A/G、A/A和G/G的孤獨癥兒童之間，非語言存在顯著性差異(P＜0.01)。見表4。

表2 exon 6 SNP不同基因型ABC得分的比較(n=30)

表3 孤獨癥組CARS評分重度組與輕中度組exon 6 SNP比較

表4 不同基因型CARS評分比較

3 討論

基因組篩查和細胞遺傳學研究顯示，7q存在孤獨癥易感基因座位[1-5]。RELN基因定位在7q22[6]，其表達產物reelin蛋白為3461個氨基酸殘基組成的巨大基質外糖蛋白，與神經元的正確遷移以及大腦皮層、小腦皮層和海馬等分層結構的正確形成有關。

研究表明，與reelin蛋白有關的任一自然突變或定向突變會影響小鼠大腦皮層分層結構的形成，導致胚胎腦的發育異常。RELN基因突變導致reelin表達異常。研究發現，孤獨癥患者腦組織和血中reelin水平比對照下降。孤獨癥患者存在海馬、內嗅皮質、杏仁核、扣帶回皮質神經解剖異常，包括神經元大小和數目的改變。海馬回負責學習和記憶，孤獨癥患兒的社會行為退縮、強迫行為、不知危險、不能從記憶庫存中提取信息、不能調節自己以適應新環境均與海馬回受損有關；損傷海馬回的動物可以出現刻板行為、自我刺激行為和多動行為。

本研究提示，exon 6 SNP與兒童孤獨癥的嚴重程度有關：攜帶基因型為G/G的患兒比攜帶基因型A/A的患兒模仿和聽覺反應能力差，攜帶基因型為G/G、A/G的患兒比攜帶基因型A/A的患兒有更嚴重的非語言交流障礙。

Weeber等報道，RELN和ApoER2基因共同作用提高海馬的突觸可塑性和學習能力[10]。RELN基因突變與人[11]和鼠[12]學習障礙、小腦發育不全、共濟失調和認知障礙明顯相關。

本研究結果與其他學者不一致可能由遺傳異質性導致，因為兒童孤獨癥是多基因復雜性疾病。也可能由于本研究樣本量較小，進一步研究應擴大樣本量并進行家系研究。

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