梵凈山仿野生天麻高效液相指紋圖譜研究

田 靜， 許亞玲， 舒 娟， 王元輝

(1.貴州省藥品集中采購服務(wù)中心貴州貴陽550002;2.貴州省藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽550000;3.銅仁地區(qū)藥品檢驗(yàn)所，貴州銅仁554300)

天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，為常用名貴中藥，主產(chǎn)于四川、云南、貴州、陜西等省，安徽省大別山區(qū)、皖南山區(qū)也有出產(chǎn)。天麻具有平肝熄風(fēng)功能，臨床上用于頭痛眩暈、肢體麻木、癲癇抽搐等癥。目前從天麻藥材中分離得到的化合物中，天麻素量最高，因此，天麻藥材和其制劑產(chǎn)品均以天麻素為指標(biāo)［1-2］。但現(xiàn)代臨床和藥理研究表明［3］，天麻制劑與天麻藥材的功效是有很大區(qū)別的;也有實(shí)驗(yàn)證明［4］，香莢蘭醇、天麻苷元以及天麻中的酚性成分等都有生物活性。因此尋找一種全面的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對天麻藥材進(jìn)行控制是十分重要的。指紋圖譜是控制天然藥物質(zhì)量的有效方式之一。另外，天麻野生資源由于人為過度采集和適宜生態(tài)因子逐漸削弱而越來越少，遠(yuǎn)不能適應(yīng)市場需求，自20世紀(jì)70年代中期開始大面積栽培供藥用，目前天麻的栽培生產(chǎn)通常在庭院或林下、室內(nèi)栽培，采用室內(nèi)或塑料大棚育種［5］。貴州省銅仁地區(qū)德江、印江兩縣選擇野生天麻分布相對集中的天麻原生林地，建立了仿野生天麻栽培基地，即在天麻生長的全過程幾乎不改變天麻野生環(huán)境狀態(tài)。為了盡快推進(jìn)中藥特色經(jīng)濟(jì)，建立天麻GAP基地，保護(hù)天麻種質(zhì)資源，有必要對各產(chǎn)地天麻開展天麻質(zhì)量的對比研究［6］。本實(shí)驗(yàn)通過對收集的10個天麻藥材樣品(包括野生天麻及對照藥材)進(jìn)行指紋圖譜的研究，以比較野生與栽培品種以及不同產(chǎn)地樣品間的差異。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試藥 日本島津LC-20AD高效液相色譜儀(具LC-20AD串聯(lián)雙泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，CBM-20A系統(tǒng)控制器，SIL-20A自動進(jìn)樣器，CTO-10ASvp柱溫箱，LCSolution色譜工作站。色譜柱:DIKMA C18(4.6 mm × 200 mm，5 μm，柱號8023933)。

AUW－120D電子天平、AY-120電子天平(日本島津公司);DZ60電熱恒溫真空干燥箱;TCQ-250超聲清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。

甲醇為色譜純，水為超純水，磷酸為分析純。

天麻對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號120944-200507)。天麻素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110807-200205)

1.2 天麻樣品來源 見表1。

表1 天麻樣品來源Tab.1 Gastrodiae Rhizome sample sources

以上樣品均經(jīng)銅仁地區(qū)藥品檢驗(yàn)所工作人員鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜分析條件 色譜柱:DIKMA C18(4.6 mm×200 mm，5 μm，柱號8023933);流動相:A 為0.1%磷酸水溶液，流動相B為0.1%磷酸甲醇溶液，二元梯度分離(梯度條件見表2);體積流量:1 mL/min;檢測波長:226 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μL。所有成分在60 min內(nèi)出峰。

表2 梯度條件Tab.2 Gradient conditions

2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉碎成粗粉，在60℃減壓干燥1 h，粉碎，取粉末(過五號篩)約0.8 g，加10 mL60%甲醇超聲提取1 h，靜置2 h，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 空白試驗(yàn) 取制備供試品溶液所用60%甲醇為空白溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明:保留時間位于0～10 min為空白溶劑峰。

2.4 樣品分析 精密吸取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。得到各樣品的HPLC圖譜。見圖1、圖2。

圖1 梵凈山野生及仿野生天麻色譜圖1.天麻素 s1.印江梵凈山 s2.德江高山s3.德江沙溪 s4.印江豆湊林 s5.德江天宇Fig.1 The wild and pseudo-wild Gastrodiae Rhizoma of Mt.Fanjing chromatograms1.Gastrodin s1.Yingjiang Mt.Fanjing s2.Dejiang Gaoshan s3.Dejiang Shaxi s4.Yinjiang Doucoulin s5.Dejiang Tianyu

圖2 天麻樣品色譜圖1.天麻素 s1.印江梵凈山 s2.德江高山 s3.德江沙溪 s4.印江豆湊林 s5.德江天宇 s6.對照藥材 s7.畢節(jié)大方 s8.湖北 s9.安徽 s10.云南Fig.2 Gastrodiae Rhizoma sample chromatograms1.Gastrodin s1.Yingjiang Mt.Fanjing s2.Dejiang Gaoshan s3.Dejiang Shaxi s4.Yinjiang Doucoulin s5.Dejiang Tianyu s6.referene herb s7.BijieDafang s8.Hubei s9.Anhui s10.Yunnan

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12、24h 等 8 個時間點(diǎn)進(jìn)行檢測，記錄色譜圖中各色譜峰的保留時間和峰面積。直觀觀察指紋圖譜的全貌無明顯變化，用相似度軟件計算，結(jié)果相似度均大于0.98，表明在此時間段內(nèi)供試品溶液的成分是穩(wěn)定的。

3.1.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察進(jìn)樣精密度，用相似度軟件計算，結(jié)果相似度均大于0.99，表明供試品進(jìn)樣精密度良好。

3.1.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次樣品5份，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，用相似度軟件計算，結(jié)果相似度均大于0.99。表明本法測定的重現(xiàn)性良好。

3.2 指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立

3.2.1 參照圖譜 本實(shí)驗(yàn)采用野生天麻樣品為參照物，所以在相似度計算時采用野生天麻樣品指紋圖譜為參照圖譜。并采用國家藥典委員會編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”計算軟件進(jìn)行相似度測定，生成標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜。

3.2.2 時間窗寬度 0.10 min。

3.2.3 數(shù)據(jù)剪切 空白試驗(yàn)表明，0～10 min為空白溶劑峰，為避免對相似度結(jié)果的影響，將供試品指紋圖譜中0～10 min內(nèi)的色譜峰予以剪切。

3.2.4 校正方式 由于該實(shí)驗(yàn)采用了梯度洗脫方式，供試品指紋圖譜中色譜峰的保留時間可能與對照圖譜中相應(yīng)的色譜峰不一致，故采用多點(diǎn)匹配，以中位法生成對照圖譜。

3.2.5 指紋圖譜相似度計算結(jié)果見表3、表4。

表3 梵凈山野生及仿野生天麻樣品相似度計算結(jié)果Tab.3 The wild and pseuolo-wild Gastrodiae Rhizoma samples of Mt.Fanjing similarity calculation results

表4 所有天麻樣品相似度計算結(jié)果Tab.4 All the Gastrodiae Rhizoma sample similarity calculation results

4 討論

4.1 檢測波長的確定 曾選用220、226、254、270 nm等波長檢測并觀察其色譜圖，結(jié)果在226 nm處各色譜峰均有較好的紫外吸收，色譜信息最為豐富。因此，選擇該波長為檢測波長。

4.2 流動相的選擇 天麻藥材所含成分復(fù)雜且極性范圍跨度很大，等度洗脫很難分離，故采用梯度洗脫方式。酚類成分呈弱酸性，酸性緩沖系統(tǒng)比純水系統(tǒng)分離更優(yōu)。分別比較了0.1%醋酸水系統(tǒng)［7］和0.1%磷酸水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)兩者的分離效果相近，考慮到中國藥典采用磷酸水系統(tǒng)測定天麻素量，故選擇磷酸水系統(tǒng)，最終確定0.1%磷酸水溶液－0.1%磷酸甲醇溶液為流動相。

4.3 提取方法及溶劑的選擇 提取方法曾選用方法 1，取粉末 4 g，回流提取 1 h，定容，用 0.45 μm 濾膜濾過;方法2，取粉末0.8g，超聲處理1 h，靜置2 h，定容，用0.45 μm濾膜濾過。提取溶劑曾分別采用甲醇、60%甲醇、稀乙醇、水提取，經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，采用60%甲醇為溶劑、方法2提取處理樣品所得實(shí)驗(yàn)效果最佳，并且處理方法操作簡便、可行。

4.4 記錄時間的選擇 按上述色譜條件，記錄60 min后，保持流動相比例不變繼續(xù)45 min色譜圖(即記錄105 min指紋圖譜)，經(jīng)與空白色譜圖比較，保留時間60～105 min內(nèi)為空白溶劑峰，故確定分析時間為60 min。

4.5 從相似度計算結(jié)果來看，銅仁地區(qū)德江、印江兩縣選擇野生天麻分布相對集中的天麻原生林地進(jìn)行栽培的仿野生天麻，由于其生長環(huán)境與野生天麻較為接近，其指紋圖譜與野生天麻的相似度均大于0.90。

4.6 從以野生天麻指紋圖譜作為參照圖譜得到的各個產(chǎn)地樣品圖譜的相似度結(jié)果來看，所收集的10個天麻藥材(包括對照藥材)，由于其產(chǎn)地、生長年限、采收季節(jié)、加工工藝等影響天麻藥材內(nèi)在質(zhì)量的因素都無法明確，所得到的指紋圖譜所表達(dá)的信息，僅代表天麻藥材商品的整體情況，故而10個樣品的相似度計算結(jié)果差異較大，1～6號樣在為1.000～0.737(參照)和0.878 ～0.854(對照)，而 7 ～10 號樣為 0.024 ～0.118(參照)和 0.025 ～0.087(對照)。本實(shí)驗(yàn)還同時對上述樣品按中國藥典方法進(jìn)行了定量測定，從天麻素測定結(jié)果來看，除云南產(chǎn)天麻樣品外，其余樣品的天麻素量均遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，因而進(jìn)一步說明了天麻藥材所含成分復(fù)雜，光以天麻素為質(zhì)量控制指標(biāo)無法反映其質(zhì)量優(yōu)劣，因此，研究天麻藥材中其它成分的變化情況為天麻藥理學(xué)研究和最大化利用提供科學(xué)依據(jù)，同時尋找一種全面的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對天麻藥材進(jìn)行控制是十分重要的。采用指紋圖譜的相似度計算，可以較好地區(qū)分不同產(chǎn)地的天麻藥材(見表4)。現(xiàn)階段，中藥的有效成分大多尚未明確，中藥指紋圖譜的整體性和模糊性正好符合中藥質(zhì)量控制的整體性要求，較單一成分或指標(biāo)成分的質(zhì)量控制方法更科學(xué)、合理［8］但在中藥指紋圖譜中，可能還含有很多未知化合物的信息，該對它們作如何處理，仍是一個尚待研究的問題。

4.7 另外，根據(jù)對天麻素測定結(jié)果的分析，野生天麻的天麻素量高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，但個體差異較大，這可能與采挖的野生天麻60%以上是抽苔開花營養(yǎng)被消耗的春麻有關(guān)。而仿野生天麻是選擇野生天麻分布相對集中的天麻原生林地進(jìn)行栽培，并且是在其質(zhì)量最佳時期采挖，所含天麻素的量均遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)。由于野生資源的匱乏，野生天麻完全不能滿足市場的需求，因此，建立符合國家GAP規(guī)范要求的天麻栽培基地來滿足市場的需求是切實(shí)可行的。

［1］楊世林，蘭 進(jìn)，徐錦堂.天麻的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2000，31(1):66.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:54.

［3］熊建明.天麻藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)報，1987，8(1):57.

［4］鄭虎占.天麻的化學(xué)和藥理學(xué)研究概況［J］.中國現(xiàn)代研究與應(yīng)用，1997，1:897.

［5］劉 杰，王春霞.栽培天麻與野生天麻質(zhì)量比較［J］.井岡山醫(yī)專學(xué)報，2004，11(4):85-86.

［6］李西林，米健芳，馬曉悅，等.HPLC法對不同產(chǎn)地天麻藥材的質(zhì)量分析［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(8):96-97.

［7］王 莉，程孟春，育紅斌，等.天麻液相色譜指紋圖譜研究［J］..中草藥，2006，37(9):1402-1405.

［8］彭苗苗，方 蕓.中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2010，21(7):659-661.