HPLC法測定苦參軟膏中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿

毛 丹， 陳 鈳， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)

苦參軟膏主要含苦參總堿，具有抗菌消炎作用，主要用于治療宮頸糜爛、赤白帶下、滴蟲性陰道炎及陰道霉菌感染等婦科慢性炎癥。原質量標準是采用酸堿滴定法［1］測定總生物堿的量，操作繁瑣，專屬性差?？鄥⒖倝A中含有苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿，是苦參總堿的主要活性成分。為有效控制藥品質量，本實驗采用反相高效液相色譜法［2-8］同時測定苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的量，為質量標準的提高和修訂提供依據。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀，紫外-可見光檢測器，Chemstation色譜工作站?？鄥A、槐定堿和氧化苦參堿對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供，批號分別為 805-200005、110784-200303、0780-200004。樣品:苦參軟膏樣品(批號為20100802，20100803，20100804)及陰性樣品均由上海寶龍藥業有限公司提供。乙腈為色譜純(Merck公司)，其余試劑均為分析純，由中國醫藥(集團)上海化學試劑公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-3柱(5 μm，0.46 cm ×15 cm)，流動相為乙腈 －0.1%磷酸溶液(18 ∶82，v/v)(三乙胺調節 pH 值至 8.0)，體積流量:1.0 mL/min，檢測波長:220 nm，柱溫:30 ℃，進樣量:5 μL。在上述色譜條件下，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的理論板數均不低于4000，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子在0.95～1.05之間。陰性對照溶液對樣品測定無干擾。結果見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿對照品適量，分別加流動相制成每1 mL 含苦參堿1.952 mg、槐定堿2.49 mg、氧化苦參堿1.002 mg的對照品溶液;精密吸取上述苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿對照品溶液各1 mL、1 mL和0.5 mL，混合，搖勻，作為對照品溶液①;另精密吸取上述苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿對照品溶液各1 mL、1 mL 和 0.5 mL，置 10 mL 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為對照品溶液②;再精密吸取對照品溶液②2 mL，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為對照品溶液③。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液1 mL，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率140 W，頻率42 kHz)30 min，放冷，離心，取上清液5 mL，減壓回收至干，殘渣加流動相溶解并轉移至5 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取按處方除去苦參總堿的陰性樣品，按2.2.2項下的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 線性關系考察 精密吸取上述對照品溶液③2 μL，對照品溶液②1 μL、2 μL、5 μL，對照品溶液①2 μL、5 μL、10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，回歸方程分別為:苦參堿Y=1059X+4.875，r=0.9999(n=7);槐定堿 Y=662.03X －1.311，r=0.9999(n=7);氧化苦參堿 Y=872.38X+0.633，r=0.9999(n=7);結果表明，苦參堿在進樣量為 0.07808 ～7.808 μg、槐定堿在進樣量為 0.0996 ～9.96 μg、氧化苦參堿在進樣量為0.02004 ～2.004 μg 范圍內峰面積與進樣量線性關系良好。

2.4 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液②，按上述色譜條件連續進樣6次，測定，計算苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰面積的RSD分別為1.6%、1.1%和1.1%，結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗 吸取同一供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于 0、4、9、14、21、25 h 進樣測定，測得苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰面積的RSD分別為1.5%、0.49%和2.1%，結果表明供試品溶液在25 h內基本穩定。

2.6 重復性試驗 取同一批樣品6份，分別按2.2.2項下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿質量分數的RSD分別為1.7%、1.2%和2.5%，結果表明樣品重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗 取9個具塞錐形瓶，分別精密加入對照品溶液(苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿質量濃度分別為 1.839 mg/mL、2.419 mg/mL、0.539 mg/mL，均用無水乙醇溶解)0.8 mL、1 mL 和1.2 mL，一式9份，以3份為一組，減壓回收至干，再取已測定的同一批樣品9份(含苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿分別為 18.0 mg/g、23.0 mg/g、3.3 mg/g)，精密稱定，置上述具塞錐形瓶中，按供試品溶液方法制備供試液，測定，結果見表1。

表1 苦參軟膏中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿加樣回收率試驗結果(n=9)Tab.1 Recoveries of matrine，sophoridine and oxymatrine in Kushen Ointment(n=9)

2.8 樣品測定 按2.2.2項下供試品溶液的制備方法和測定條件，取2.2.1項下對照品溶液②作為對照品溶液，對3批樣品中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿進行測定，用外標法計算，結果見表2。

表2 苦參軟膏中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿測定結果(n=3)Tab.2 Content of matrine，sophoridine and oxymatrine in Kushen Ointment(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿混合對照品溶液經二極管陣列檢測器進行紫外光譜掃描，結果分別在204 nm、202 nm、202 nm處有最大吸收［9］，但在220 nm波長下，干擾少，基線穩定，重現性好，而且吸收度合適，故選擇220 nm作為檢測波長［10］。

3.2 流動相和色譜柱的選擇 參照中國藥典2010年版一部“苦參”項下方法［11］188，以氨基鍵合硅膠為填充劑，以乙腈－無水乙醇－3%磷酸溶液(80∶10∶10)為流動相［12］，結果得到的供試品色譜圖中，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰不對稱，且槐定堿與氧化苦參堿色譜峰的分離度稍差;又參照中國藥典2010年版一部“消銀片”項下方法［11］1038，采用Inertsil ODS-3 的色譜柱(5 μm，0.46 cm ×15 cm)，以乙腈－0.1%磷酸溶液(18∶82)(三乙胺調節pH值至8.0)為流動相［13］，結果得到的供試品色譜圖中，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿色譜峰較對稱，且與其他色譜峰均分離良好，故選擇該色譜柱與流動相系統進行檢測。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇 苦參總堿中主要含有生物堿類成分，供試品溶液制備方法采用加濃氨試液使生物堿游離后加有機溶劑提取的方法［14］。為有效提取出苦參軟膏中的生物堿類成分，對供試品溶液制備方法中濃氨試液的加入量、提取溶劑、提取方式等分別進行了考察。試驗中對提取溶劑進行選擇時，分別篩選了二氯甲烷、三氯甲烷和乙醚3種試劑，結果發現用三氯甲烷超聲處理提取效率最高，故采用三氯甲烷作為提取溶劑。濃縮方式分別采用蒸干、減壓回收至干2種進行比較，結果表明，蒸干會導致所測定成分的含量偏低，故選擇減壓回收至干作為樣品的濃縮方式。同時我們在試驗時還發現，使用無水乙醇配制的對照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜圖中溶劑峰對所測定的成分有干擾，故選擇用流動相制備對照品溶液和供試品溶液。通過對供試品溶液的提取方法等進行考察，最終確定了前述提取方法。

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