丹酚酸D穩定性研究

繆興龍， 靳元鵬， 張蘭蘭， 周水平， 郭治昕*

(1.天津中醫藥大學，天津300193;2.天津天士力集團有限公司，天津300410)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩和滋補作用，在臨床上用于心腦血管疾病、癌癥、抗衰老等方面的治療［1］。丹參中的化學成分主要為脂溶性和水溶性兩類，脂溶性成分主要為丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等;水溶性成分主要是酚酸類，包括丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、丹酚酸 A、丹酚酸 B、丹酚酸D、迷迭香酸等［2］。丹酚酸類成分具有抗氧化、保護腦組織細胞損傷、保護心腦血管系統的作用［3］。但由于丹酚酸類成分不穩定，導致一些以丹酚酸水溶性成分為主的丹參制劑在生產過程中成分容易發生變化，給制劑生產過程中的質量控制帶來影響。文獻報道的此類物質的研究以丹酚酸B為主，丹酚酸B易受加熱溫度、加熱時間和pH影響而發生水解反應［4］;丹酚酸B在一定條件可轉化為丹酚酸A，從而用于丹酚酸A的制備［5］。目前尚未見有關丹酚酸D(salvianolic acid D，SalD)的相關研究，因此本實驗針對丹酚酸D的穩定性進行考察，采用高效液相色譜測定不同影響因素下的峰面積變化，為制劑生產過程中的穩定性控制提供實驗依據;同時觀察不同實驗條件下其它一些丹酚酸類成分的生成情況，了解丹酚酸D與其它丹酚酸成分間的轉化關系。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1100，數據處理軟件為ChemStation);電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司);KQ-500DB型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HI 9025 microcomputer pH meter(Hanna Instruments Pte Ltd);TC-10K型電子天平(常熟雙杰測試儀器廠);BUCHI Rotavapor R-200;BUCHI Heating Bath B-490;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);調溫電熱套(北京中興偉業儀器有限公司)。

1.2 材料、試劑 丹參藥材購于陜西商洛GAP基地，經天津天士力制藥股份有限公司鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參的干燥根及根莖;AB-8樹脂(天津興南允能高分子技術有限公司);聚酰胺(臺州市路橋四甲生化塑料廠);MCI填料(日本三菱公司);色譜乙腈(Merck公司);濃鹽酸、磷酸、氫氧化鈉固體(分析純);蒸餾水(Milli-Q制備);丹參浸膏(天津天士力制藥股份有限公司生產車間提供)。

1.3 樣品制備 丹參浸膏適量水溶解，上AB-8樹脂柱，水洗脫得含丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸D的洗脫液;將上述洗脫液用濃鹽酸調節至pH=3，再次上AB-8樹脂柱，pH=3的酸水洗脫，除去丹參素及原兒茶醛，然后用95%乙醇溶液將迷迭香酸、丹酚酸D洗脫下來;將95%乙醇洗脫液減壓濃縮后，上聚酰胺色譜柱，依次用30%、40%乙醇溶液洗脫，得到丹酚酸D溶液，減壓濃縮得丹酚酸D粗品;再將丹酚酸D粗品溶解，過MCI色譜柱，依次用10%、20%乙醇溶液洗脫，得丹酚酸D溶液，減壓濃縮得丹酚酸D樣品。

1.4 pH值對丹酚酸D穩定性影響 丹酚酸D樣品40 mg用300 mL蒸餾水溶解，量取丹酚酸D水溶液4份，每份50 mL，分別用濃鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調節pH為1、3、5、7。將4份不同pH的丹酚酸D水溶液進行加熱回流10 h，定時取樣檢測，以峰面積比表征丹酚酸D變化情況。

1.5 不同體積分數乙醇溶液對丹酚酸D穩定性影響 丹酚酸D樣品40 mg分別用300 mL的30%、60%、90%乙醇溶液溶解，各量取丹酚酸D溶液4份，每份50 mL，分別用濃鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調節pH為1、3、5、7。將4份不同 pH的丹酚酸 D不同濃度乙醇溶液進行加熱回流10 h，定時取樣檢測，以峰面積比表征丹酚酸D變化情況。

1.6 溫度對丹酚酸D穩定性影響 根據丹酚酸D在不同水-乙醇溶液中穩定性影響研究的基礎上，進行丹酚酸D在不同溫度下穩定性研究。丹酚酸D樣品40 mg用300 mL適宜溶液溶解，量取丹酚酸D溶液4份，每份50 mL，分別用濃鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調節pH為1、3、5、7。將4份不同pH的丹酚酸D溶液置于不同溫度下保存10 h，定時取樣檢測，以峰面積比表征丹酚酸D變化情況。

2 結果

2.1 色譜條件［6］色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm × 250 mm);流動相 A:0.02% 磷酸水溶液，流動相B:乙腈-0.02%磷酸水溶液(80∶20)，梯度洗脫(0 min，A:90%;0 ～8 min，A:90%→78%;8～15 min，A:78% →74%;15～55 min，A:74%→48%);體積流量1 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30℃;檢測波長280 nm。

此方法為復方丹參滴丸質量控制方法的色譜條件，可同時檢測6種丹參水溶性成分:丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。見圖1。

圖1 6種丹酚酸成分色譜圖Fig.1 The chromatogram of six salvianolic acid components

2.2 樣品測定 1.3項制備的丹酚酸D樣品進行HPLC檢測，歸一化法計算丹酚酸D峰面積大于90%，結果見圖2。

圖2 丹酚酸D樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of salvianolic acid D sample

2.3 pH值對丹酚酸D穩定性影響 結果見表1和圖3。

表1 調節pH及加熱回流10 h后變化情況Tab.1 The content changes after pH adjustment and refluence 10 hours

圖3 加熱回流10 h后成分變化情況Fig.3 The component changes after refluence 10 hours

調節丹酚酸D水溶液的 pH分別至1、3、5、7后，丹酚酸D峰面積基本保持不變。不同pH的丹酚酸D水溶液隨著加熱時間的增加，丹酚酸D的峰面積逐漸減少;不同pH的丹酚酸D水溶液加熱回流10 h后丹酚酸D均發生轉化，轉化產物有丹參素和原兒茶醛(在所用檢測條件下測得，以下相同)，丹酚酸D減少量越多，丹參素和原兒茶醛的轉化量越多。

由于丹酚酸類成分具有酚羥基，使丹酚酸類成分在堿性條件下極易成鹽，導致丹酚酸類成分發生化學變化，因此本實驗不對堿性條件下的丹酚酸D進行研究。通過實驗研究發現不同pH的丹酚酸D水溶液加熱后，丹酚酸D峰面積逐漸減少，溶液pH不同峰面積減少程度不同。pH為3～7的水溶液中丹酚酸D較pH=1的水溶液中穩定，但隨著受熱時間的增加，其峰面積不斷減少;因丹酚酸D為弱酸性成分，故在弱酸性條件下相對穩定。丹酚酸D峰面積不斷減少可能是由于高溫及H+催化使丹酚酸D發生轉化。丹酚酸類成分大部分為咖啡酸的聚合物［7］，其中丹參素為咖啡酸的單體化合物，丹酚酸D為咖啡酸的二聚物，丹酚酸D結構中含有酚羥基、酯鍵及羧基，溶液在加熱過程中丹酚酸D容易發生分解及被氧化，使丹酚酸D發生轉化，轉化為其它小分子的物質如丹參素和原兒茶醛等。隨著加熱時間的延長丹酚酸D量逐漸減少，丹參素和原兒茶醛的峰面積逐漸增加，與文獻中報道的丹參素、原兒茶醛量隨著丹參藥材提取液的受熱時間延長量持續增加具有一定的相似性［8-10］。化學結構見圖4。

圖4 丹酚酸D，丹參素，原兒茶醛化學結構Fig.4 The chemical structure of SalD，DSS，PA

2.4 不同體積分數乙醇溶液對丹酚酸D穩定性影響 結果見表2和圖5、6、7。

表2 不同溶液中加熱回流10 h后變化情況Tab.2 The content changes in different solvents after refluence 10 hours

丹酚酸D在不同體積分數乙醇溶液中加熱回流后峰面積均有不同程度減少:pH=1的4種溶液中丹酚酸D均不穩定，變化較大;pH=3，丹酚酸D在水溶液、30%乙醇溶液及60%乙醇溶液中較90%乙醇溶液中穩定，但仍有部分發生轉化;pH=5的4種溶液中丹酚酸D穩定性差異不大，較為穩定;pH=7，丹酚酸D在30%、60%乙醇溶液中較其他2種溶液中穩定。

圖5 30%乙醇溶液中加熱回流10 h后成分變化情況Fig.5 The component changes in 30%EtOH solution after refluence 10 hours

圖6 60%乙醇溶液中加熱回流10 h后成分變化情況Fig.6 The component changes in 60%EtOH solution after refluence 10 hours

圖7 90%乙醇溶液中加熱回流10 h后成分變化情況Fig.7 The component changes in 90%EtOH solution after refluence 10 hours

不同溶液中的轉化關系:在水溶液中主要轉化為丹參素、原兒茶醛;在乙醇溶液中可轉化為丹酚酸A、丹酚酸B，且乙醇的體積分數越大轉化的丹酚酸A和丹酚酸B越多。丹酚酸D在水溶液中可能是其自身發生降解轉化生成丹參素和原兒茶醛;而丹酚酸D在乙醇溶液中可能發生降解和縮合反應，生成丹酚酸A和丹酚酸B。丹酚酸A為咖啡酸的三聚物，由一分子丹參素和兩分子咖啡酸縮合而成，丹酚酸B為咖啡酸的四聚物，由三分子丹參素和一分子咖啡酸縮合而成。丹酚酸A、B可能的生成途徑:①丹酚酸D與丹酚酸D轉化得到的丹參素和原兒茶醛縮合而成;②丹酚酸D的轉化產物丹參素和原兒茶醛等小分子成分縮合而成;③ 另外，丹酚酸B還可由兩分子丹酚酸D縮合而成。化學結構見圖8。

圖8 丹酚酸A，丹酚酸B化學結構Fig.8 The chemical structures of SalA，SalB

2.5 溫度對丹酚酸D穩定性影響 結果見表3。

表3 不同溫度10 h后變化情況Tab.3 The content changes in different temperatures after 10 hours

丹酚酸D在低溫條件下穩定，峰面積變化較小，隨著溫度的升高丹酚酸D的峰面積逐漸減少;溫度越高，丹酚酸D峰面積變化越大。

3 討論

丹酚酸D在弱酸性條件下相對穩定;不同體積分數的乙醇溶液對丹酚酸D的穩定性影響較小;低溫條件下丹酚酸D穩定，隨著溶液加熱溫度的升高丹酚酸D峰面積逐漸減少，發生轉化。丹酚酸D在水溶液中可轉化為丹參素和原兒茶醛，在乙醇溶液中可轉化為丹酚酸A、丹酚酸B。

丹酚酸D水溶液在高溫強酸(pH=1)條件下有利于丹參素轉化;丹酚酸D 90%乙醇溶液在高溫弱酸(pH值為3～7)條件下有利于丹酚酸A、丹酚酸B的轉化。丹酚酸D在水溶液和乙醇溶液中轉化后產物不同，說明丹酚酸D在水和乙醇溶液中的轉化途徑存在一定的差異。

在制劑生產過程中丹酚酸D溶液應處在低溫及弱酸的條件下，以防止丹酚酸D發生轉化，導致成分量減少。

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