HPLC法測定峨參中峨參內酯

王岳峰， 劉苡菡， 耿 耘， 馬超英

(西南交通大學峨眉校區，四川峨眉山614202)

峨參為傘形科峨參屬植物峨參Anthriscus sylvestris(L.)Hoffm.的根，與峨蕊、雪磨芋，歷來被人們認為是峨眉山的三大特產而聞名遠近。中醫認為峨參有補中益氣，祛瘀生新之功效［1］。性甘、味辛、微苦，入脾、胃、肺三經。分布于峨眉山地區的神殿附近的峨山溝、九老洞、金頂，野生于灌木林緣、草坡。峨參中主要含有峨參內酯，具有殺蟲、抑制癌細胞增殖，抗病毒、抗癌和抗有絲分裂的作用［2］。峨參屬植物生長迅速，資源豐富。峨參在我國用作滋補強壯藥，沿用歷史悠久。國外學者對峨參、刺果峨參、東北峨參等植物做了部分研究，研究部位主要包括根，葉，花和種子等，從峨參中分離出殺蟲、抗癌、抗有絲分裂、抗病毒的有效物質。峨參的化學成分主要有峨參內酯、異峨參內酯、水芹酮以及紫花前胡苷、東莨宕苷等。文獻《Volatile components from Anthriscus sylvestris(L.)Hoffm.》是關于峨參化學成分研究的最新(2002年)的一篇報道，從峨參中用水蒸氣蒸餾法分離得到數十種揮發性成分。國內有關峨參的研究，多是從生態學［3-4］、栽培學［5-6］等方面進行的。關于峨參化學成分方面的研究，國內文獻報道微乎其微。目前，對峨參中峨參內酯的定量測定報道尚無研究。本實驗旨在利用高效液相色譜法測定10個不同批次的峨參中峨參內酯，計算出其質量分數范圍，為峨參的質量標準的制定提供基礎性研究資料。

1 儀器、藥品試劑及藥材

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀，大連中匯達 VP-ODS C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)。

1.2 藥品試劑 峨參內酯對照品(實驗室自制);甲醇為色譜純(科密歐);水為超純水;其他試劑均為分析純，使用前均經0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3 藥材 藥材均由西南交通大學生命科學與工程學院宋良科教授鑒定。來源見表1。

表1 藥材來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件 大連中匯達 VP-ODS C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)，檢測波長 293 nm，流動相甲醇-水(52∶48)為流動相，柱溫35℃，體積流量1.0 mL/min。進樣量 10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取峨參內酯對照品0.0075 g，用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中，配制成質量濃度為0.075 mg/mL的溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取峨參粉末4.0 g，置錐形瓶中，稱定質量。樣品瓶中直接加入48 mL規定濃度的甲醇溶液，回流3次，每次60 min，每次回流后，補足質量，過濾，沖洗濾渣和錐形瓶，合并3次濾液與洗液，減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解，并定容于10 mL量瓶中。微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得供試品溶液。

2.4 標準曲線 取峨參內酯對照品溶液，分別精密吸取 2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL 進入液相色譜儀，測定峰面積。試驗結果表明:峨參內酯的標準曲線為 Y=570852.60X － 24604.56，r=0.9998(n=6)，峨參內酯在0.1875 ～1.1250 μg范圍內進樣量與峰面積成良好線性關系。

2.5 精密度試驗 取質量濃度為0.075 mg/mL的溶液，精密量取10 μL，連續進樣5次，考察峰面積，計算相對標準偏差，RSD為0.2088%。試驗結果表明，精密度良好。

2.6 穩定性試驗 精密稱取同一峨參樣品4 g，按2.3 項方法制備供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，計算各色譜峰峰面積的相對標準偏差，峰面積的RSD=1.12%(n=6)，表明樣品在24 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗 取同一批樣品5份，依法制備成供試品溶液，精密吸取10 μL測定相對峰面積，計算相對標準偏差，RSD為1.9337%(n=6)，重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知量(0.0416%)的9 號樣品 4.0 g，置錐形瓶中，稱定質量。樣品瓶中直接加入50 mL規定濃度的甲醇溶液，回流3次，每次60 min，每次回流后，補足質量，過濾，沖洗濾渣和錐形瓶，合并3次濾液與洗液，并用甲醇定容于25 mL量瓶中。精密吸取1 mL提取液，置100 mL量瓶中，再分別加入峨參內酯對照品0.0800 mg/mL的對照品溶液10 mL，用甲醇定容至刻度。平均操作5次，精密吸取10 μL在293 nm處測定吸光度，計算得回收率，結果表明平均回收率為100.3%，RSD=0.52%，回收試驗良好。具體見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

2.9 測定結果 取10個批次的樣品，依次精密稱定峨參粉末4.0 g，分別加入95%乙醇50 mL，稱定質量，各提取1 h，放冷，再稱定質量，用95%乙醇補足減失的質量，濾過并減壓蒸干，殘渣用甲醇定容于10 mL量瓶中。平行操作兩次。測定峰面積，計算峨參內酯的量。結果見表3。

表3 測定結果

3 討論

本研究是建立在考察了峨參內酯的提取工藝的基礎上，通過HPLC測定方法的探索和方法學考察，根據對10批峨參中峨參內酯測定的結果，提出了在190～700 nm的波長范圍對峨參內酯對照品進行紫外掃描，確定293 nm作為檢測波長，峨參藥材中峨參內酯的質量分數不應低于0.040%的建議。當然，是否有更能反映峨參質量的活性成分作為指標，還有待于進一步深入研究。

［1］王鳳岐，吳大真.峨眉神效驗方［M］.北京:科學普及出版社，1982:42.

［2］王志光，尹述凡.脫氧鬼臼毒素殺蟲作用機理初步研究［J］.中國醫藥工業雜志，1992，23(2):65 ～68.

［3］夏光敏，李忠誼，于家駒，等.峨參原生質體的體細胞胚同步化發生及植株再生［J］.實驗生物學報，1991，24(4):4-6.

［4］關若華，葛 瀅，常 杰，等.明黨參、峨參光合與生長的研究［J］.浙江大學學報，2003，30(5):584-586.

［5］殷現偉，常 杰，邱英雄，等.瀕危植物明黨參和非瀕危植物峨參種子休眠和萌發比［J］.生物多樣性，2002，10(4):425-430.

［6］盛海燕.環境因素對傘形科兩種植物種子萌發的影響［J］.生態學報，2004，24(2):221-226.