腫節風總黃酮對阿糖胞苷誘發小鼠S180血小板減少模型的影響

章武強 ，蘇 敏 ，陳 奇

1.江西省兒童醫院急診室，江西 南昌 330006；2.陜西宏府怡悅制藥有限公司新藥部，陜西 西安 710065；3.江西中醫學院藥理教研室，江西 南昌 330006

腫節風為金粟蘭科多年生草本植物草珊瑚Sarcandraglabra（Thunb.）Nakai的地上部分或干燥全草，又名草珊瑚。具有活血化瘀，消腫散結，涼血止血功能，臨床用于血熱妄行，皮膚紫斑，原發性及繼發性血小板減少性紫癜，收載于《中國藥典》2010年版。鐘立業等[1-2]曾進行了腫節風對大劑量化療后小鼠血小板減少的防治作用的研究，結果證實腫節風具有對抗大劑量5-氟尿嘧啶所造成的血小板減少的作用，可預防并治療化療后血小板減少癥的發生。徐國良等[3]曾報道腫節風分離總黃酮部位為抗免疫性血小板減少性紫癜的有效成分。以往研究都是以正常健康小鼠為研究對象，尚未有人以荷瘤小鼠為研究對象，觀察其對血小板減少的影響。本文以腫節風浸膏經大孔樹脂分離提純所得的總黃酮[4-5]為實驗藥品，研究其對阿糖胞苷化療后小鼠肉瘤S180造成的血小板減少作用。

1 資料與方法

1.1 藥品及試劑

碘伏，75%酒精，苦味酸，乙二胺四乙酸鈉（Na2-EDTA·2H2O，150g/L），0.9%氯化鈉注射液，阿糖胞苷（Ara-C，50 mg/支），臨用前用0.9%氯化鈉注射液配成10 mg/ml及5 mg/ml，腫節風總黃酮（ZJF，使用前用蒸餾水配制成所需濃度）。

1.2 動物

昆明種小白鼠，5～8周齡，體重20～22 g，雌雄各半，由江西南昌大學醫學院提供，小鼠肉瘤S180由浙江醫學科學研究院提供。

1.3 器材

超凈工作臺[SANYOMCV-B161S（T）]，手術刀、手術剪、鑷子，注射器，50 ml錐形瓶，酒精燈，灌胃針頭，電子天平（上海天平儀器廠），電熱恒溫真空干燥箱（D2-88，上海躍進醫療器械廠），血球儀（Swellab Autocounter 900+）。

1.4 荷瘤小鼠血小板減少模型的建立[6]

1.4.1 接種 將腹腔接種肉瘤S180細胞后一周的昆明種小白鼠頸椎脫臼處死，用碘伏、75%乙醇腹部局部消毒，在無菌條件下取出腹水，與生理鹽水1∶3稀釋，給每只小鼠腋窩皮下準確接種瘤液0.2 ml。

1.4.2 分組給藥 ①接種后24 h分組，每組11只動物，實驗共分3組，陰性對照組（0.2 ml/10 g），阿糖胞苷高劑量組[200 mg/（kg·d）]，阿糖胞苷低劑量組[100 mg/（kg·d）]。 用苦味酸作標記，阿糖胞苷高劑量組腹腔注射200 mg/kg，阿糖胞苷低劑量組腹腔注射 100 mg/kg，1次/d，連續2 d，第3天開始阿糖胞苷高劑量組和低劑量組都改用50 mg/kg作為維持劑量繼續腹腔注射，1次/d，連續3 d。誘導時間為5 d，陰性對照組每天注射同體積的生理鹽水，以造模組血小板下降了陰性對照組血小板記數的20%～30%為造模成功的標準。②50只接種成功的荷瘤小鼠，24 h后按體重隨機分為5組，分別為陰性對照組，阿糖胞苷組，阿糖胞苷+腫節風總黃酮（150 mg/kg），阿糖胞苷+腫節風總黃酮（200 mg/kg），阿糖胞苷+腫節風總黃酮（250 mg/kg）5組。除陰性對照組外，其余每組于分組后腹腔注射給予阿糖胞苷100 mg/kg，連續2 d，第3天改用50 mg/kg作為維持劑量繼續腹腔注射，1次/d，連續3 d。誘導時間為5 d。后三組灌胃給腫節風總黃酮，1次/d，連續10 d，于第11天處死。

1.5 觀察指標

外周血象檢測：以阿糖胞苷為對照組的荷瘤小鼠，在造模后第3、5、7、10天于眼眶后靜脈叢取2滴血于加Na2-EDTA·2H2O已干燥的試管中，用手指彈試管，使血盡量與Na2-EDTA·2H2O接觸，1 h內用全自動血球儀檢測，觀察血小板數（PLT）、白細胞數（WBC）、紅細胞數（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）的變化。

1.6 統計學方法

應用SPSS 13.0統計軟件進行處理。實驗數據以均數±標準差（）表示，實驗組與陰性對照組比較，采用獨立樣本的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 阿糖胞苷對外周血白細胞數（WBC）的影響

腹腔阿糖胞苷200 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d組及阿糖胞苷100 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d組在給藥后第7天白細胞數量均顯著降低，且阿糖胞苷200 mg/kg組白細胞降的更低，導致小鼠死亡率也較高。見表1。

表1 給藥后各組外周血白細胞數的變化過程（）

表1 給藥后各組外周血白細胞數的變化過程（）

注:與陰性對照組比較，△△P<0.01

WBC（×109/L）

2.2 阿糖胞苷對外周血血小板數（PLT）的影響

腹腔注射阿糖胞苷200 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d組及阿糖胞苷100mg/kg×2 d+50mg/kg×3 d組均能明顯的降低血小板，且在實驗第7、10天血小板能夠明顯的降低。見表2。

2.3 阿糖胞苷對外周血紅細胞數（RBC）的影響

腹腔注射阿糖胞苷200 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d組及阿糖胞苷 100mg/kg×2 d+50mg/kg×3 d 組造模后，3、5、7、10 d 外周紅細胞的數量均沒有發生很大的變化（P＞0.05）。見表3。

2.4 阿糖胞苷對外周血血紅蛋白含量（HGB）的影響

注射阿糖胞苷200 mg/kg及100 mg/kg造模后，外周血紅蛋白含量沒有發生很大的變化，P＞0.05，見表4。

表2 給藥后各組外周血血小板數的變化過程（）

表2 給藥后各組外周血血小板數的變化過程（）

注：與陰性對照組比較，△△P<0.01

組別 劑量 例數PLT（×109/L）3 d 5 d 7 d 10 d陰性對照組Ara-C 0.2 ml/10g 200 mg/kg 100 mg/kg 11610456.6±63.1390.8±100.5370.0±57.4590.6±134.9386.3±32.9△△533.0±83.9626.6±129.9274.9±141.7△△380.2±112.4△△790.3±194.0483.1±112.1△△497.2 ± 110.1△△

表3 給藥后外周血紅細胞數的影響（）

表3 給藥后外周血紅細胞數的影響（）

陰性對照組Ara-C組別 劑量 例數0.2 ml/10 g 200 mg/kg 100 mg/kg RBC（×1012/L）3 d 5 d 7 d 10 d 116108.8±1.08.6±0.98.4±1.29.0±1.39.1±1.28.3±1.18.0±1.27.9±2.08.3±0.56.4±0.86.0±0.76.5±1.1

表4 給藥后外周血血紅蛋白含量的影響（）

表4 給藥后外周血血紅蛋白含量的影響（）

陰性對照組Ara-C組別 劑量 例數0.2 ml/10 g 200 mg/kg 100 mg/kg HGB（g/L）3 d 5 d 7 d 10 d 11610160.3±13.1153.5±10.1177.7±24.6126.0±15.2114.3±6.2134.8±42.7157.6±32.0151.1±27.1150.6±17.6132.8±23.4128.9±21.4128.5±19.8

2.5 腫節風總黃酮對阿糖胞苷造成荷瘤小鼠外周血象的影響

阿糖胞苷100 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d能夠明顯造成PLT、WBC的降低。腫節風總黃酮在第7天對白細胞有顯著的影響，在第10天對血小板有顯著的影響。見表5、6。

表5 腫節風總黃酮對阿糖胞苷致荷瘤小鼠外周血象的影響（第7天）（，n=10）

表5 腫節風總黃酮對阿糖胞苷致荷瘤小鼠外周血象的影響（第7天）（，n=10）

注：與陰性對照組比較，△△P<0.01；與 Ara-C 組相比，*P<0.05，**P<0.01

陰性對照組Ara-C Ara-C+ZJF組別 劑量（mg/kg）0.2 ml/10 g 100150200250 PLT（×109/L）626.6±129.9274.9±141.7△△251.0±88.1308.3±60.9257.6±51.1 WBC（×109/L）5.9±2.02.1±0.5△△4.5±0.45.6±1.2**5.2±0.9*RBC（×1012/L）8.0±1.27.9±2.09.0±1.89.1±1.28.4±1.1

3 討論

阿糖胞苷是引起骨髓再生低下或障礙且伴全血細胞減少的藥物，因此實驗研究利用其制作血小板減少模型。以往的研究[7-9]限于觀察腫節風和阿糖胞苷對正常健康小鼠血小板的影響，但是臨床上阿糖胞苷僅限于腫瘤患者，因此本文以荷瘤小鼠為研究對象，觀察其對荷瘤小鼠血小板的影響。實驗證明，荷瘤小鼠腹腔注射200 mg/kg和100 mg/kg均可造成血小板減少模型，但是由于荷瘤鼠免疫力差，200 mg/kg會導致老鼠死亡率高，100 mg/kg在實驗第7～10天內可以造成血小板減少模型，老鼠死亡率低，因此，我們認為100 mg/kg的阿糖胞苷制作血小板減少模型更適合。腫節風總黃酮在實驗第7天對該阿糖胞苷造成的血小板減少模型有升高白細胞的作用，在第10天有升高血小板的作用。因此，對臨床用藥也有提示作用。據文獻報道其作用機制可能是腫節風減輕化療藥物對骨髓系統的抑制，加速骨髓的巨核系造血功能的恢復，從而防止化療后血小板減少的發生。

表6 腫節風總黃酮對阿糖胞苷致荷瘤小鼠外周血象的影響（第10天）（，n=10）

表6 腫節風總黃酮對阿糖胞苷致荷瘤小鼠外周血象的影響（第10天）（，n=10）

注： 與陰性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01； 與 Ara-C組相比，*P<0.05，**P<0.01

陰性對照組Ara-C Ara-C+ZJF組別 劑量（mg/kg）0.2 ml/10 g 100150200250 PLT（×109/L）790.3±194.0440.0±189.9△△516.1±118.8517.4±159.3588.9±161.1**WBC（×109/L）6.1±2.65.7±1.9△4.1±2.26.1±2.27.8±2.4*RBC（×1012/L）6.4±1.36.0±0.95.5±1.05.8±0.96.6±1.4

[1]鐘立業,劉天浩,陳運賢,等.腫節風防治化療后血小板減少癥的研究[J].中藥材,2005,28(1):36-37.

[2]鐘立業.血小板減少癥治療的研究進展[J].血栓與止血學,2001,7(4):178-180.

[3]徐國良,肖兵華,陳奇,等.腫節風及其分離部位對免疫性血小板減少性紫癜小鼠血小板的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2005,11(4):33-35.

[4]倪小蘭,徐國良,肖兵華,等.腫節風浸膏中的總黃酮和香豆素部位的譜圖指紋差異研究[J].中成藥,2008,30(5):628-630.

[5]徐國良,肖兵華,鄒胡斌,等.大孔吸附樹脂分離腫節風中總黃酮的研究[J].中草藥,2006,37(7):1014-1017.

[6]陳奇.中藥藥理研究方法學[M].2版.北京:人民衛生出版社,2006:1006.

[7]王菲,袁勝濤,朱丹妮.腫節風抗腫瘤活性部位的化學成分[J].中國天然藥物,2007,5(3):174-178.

[8]徐國良,肖兵華,陳奇,等.阿糖胞苷誘發小鼠血小板減少模型的研究[J].中國臨床藥理學與治療學,2005,10(4):387-390.

[9]趙詩云,彭旦明,周名智,等.腫節風對小鼠白細和血小板的影響[J].上海實驗動物科學,2000,20(3):154-156.