人前列腺特異性膜抗原基因重組腺病毒的構建及其表達

楊明花 王 帥 田 昕 李 妍 隋承光 (中國醫科大學第一附屬醫院腫瘤研究所，遼寧 沈陽 110001)

前列腺癌在歐美國家是最常見的男性惡性腫瘤之一，據統計，2008年美國有28 660人死于前列腺癌，同時有186 320例新增病例〔1〕，我國前列腺癌發病率也呈明顯上升的趨勢，尤其在老年男性人群中發病率較高〔2〕。前列腺特異膜抗原(PSMA)是一種較前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)更加敏感和特異的前列腺癌(PCa)腫瘤標記物，已成為前列腺癌研究中的熱點之一〔3〕。PSMA是存在于前列腺腺上皮細胞胞膜的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在前列腺癌基因治療中具有良好的靶向性〔4〕。重組復制缺陷型腺病毒作為基因治療和蛋白表達載體，已成為基因免疫治療研究中最為廣泛的載體之一。本實驗通過腺病毒 Adxsi系統構建一種能高效表達人類PSMA基因的重組腺病毒，為下一步研究用其制備樹突細胞疫苗治療前列腺癌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pCMV-SPORT6/PSMA質粒、pShuttle-CMV-EGFP穿梭質粒和pAdxsi腺病毒骨架質粒均由本室保存，所用限制性內切酶均購自New England Biolabs公司;T4 DNA連接酶購自晶美生物公司;CIP(Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal)酶購自promega公司;pfx DNA聚合酶購自Invitrogen公司;dNTP購自上海生工生物工程技術服務有限公司;引物合成于上海生工生物工程技術服務有限公司;質粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒(柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒 (柱離心型)均購自威格拉斯生物技術(北京)有限公司;1 kb DNA ladder購自鼎國生物公司;DNA Marker DL2000為大連寶生物的TAKARA產品，兔抗人PSMA單克隆抗體購自Epitomics公司;羊抗兔二抗購自中杉公司;兔抗人β-actin多克隆抗體購自康為世紀公司。大腸桿菌DH5α超級化學感受態，HEK293細胞由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 PSMA基因片段的克隆 參照PSMA序列設計一對上下游中均含有SfiⅠ酶切位點的引物，以pCMV-SPORT6/PSMA為模板，高保真酶(pfx DNA ploymerase)進行 PCR擴增，獲得PSMA基因片段。

1.2.2 pShuttle-GFP-PSMA穿梭質粒的構建及鑒定 將回收后的PSMA基因片段和腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV-EGFP均用SfiⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，柱離心型DNA純化試劑盒回收獲得的約2.2 kb的PSMA基因片段和5.1 kb的載體DNA片段。以分子濃度比為3∶1比例，將回收后的PSMA基因與載體DNA片段用T4 DNA連接酶，于22℃下連接4 h，連接產物轉化化學感受態大腸桿菌DH5 α，接種卡那霉素平板培養過夜，挑取陽性克隆擴增培養，質粒小/中量提取純化試劑盒純化質粒，獲得重組穿梭質粒pShuttle-GFP-PSMA。分別對重組pShuttle-GFP-PSMA穿梭質粒和空載體pShuttle-CMV-EGFP進行SfiⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定有無PSMA基因片段。為確保重組質粒pShuttle-GFP-PSMA中插入序列及讀碼框架的正確性，送交上海生工進行測序鑒定。

1.2.3 重組腺病毒質粒pAdxsi-GFP-PSMA的構建及鑒定 用I-CeuI和I-SceI雙酶切處理穿梭質粒pShuttle-GFP-PSMA，跑膠回收含目的基因的片段，同時用I-CeuI和I-SceI雙酶切處理pAdxsi載體，并做CIP去磷酸化處理，乙醇沉淀法回收載體，將處理好的載體片段和插入片段用T4 DNA連接酶進行連接，取3 μl連接產物轉化化學感受態細胞DH5α菌株，涂布到氨芐抗性固體培養基平皿，挑取若干陽性克隆菌落，接種到氨芐抗性液體培養基中培養過夜，質粒小/中量提取純化試劑盒純化質粒，獲得重組腺病毒質粒pAdxsi-GFP-PSMA。同法制備不含目的基因的對照重組腺病毒質粒pAdxsi-GFP。用XhoI酶分別對重組腺病毒質粒pAdxsi-GFP-PSMA和空載體pAdxsi-GFP進行酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察重組腺病毒質粒的構建是否正確。

1.2.4 重組人PSMA腺病毒的包裝、擴增及純化 用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養HEK293細胞，待細胞融合至80% ～90%時轉染重組腺病毒。將鑒定正確的攜帶PSMA基因的腺病毒質粒用PacI限制性內切酶線性化，Lipofectamine2000介導轉染HEK293包裝細胞，37℃，5%CO2培養箱中孵育，7～12 d后可觀察到細胞病變效應(CPE)，并可在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達，收集細胞，離心后棄上清，用1 ml PBS重懸細胞，－80℃、37℃反復凍融3次，離心，收集病毒上清液。取40% ～50%上清液重新感染80%～90%的HEK 293細胞，以相同的方法反復凍融4次，收上清液，用CsCl密度梯度離心法純化病毒，分裝成小份，－80℃凍存備用。

1.2.5 重組腺病毒質粒的提取鑒定及滴度測定 取重組病毒上清 10 μl，加 2 μl蛋白酶 K(10 mg/ml)，50℃孵育 1 h，100 ℃煮沸5 min，離心后取上清2 μl做模板，PCR鑒定重組病毒。將HEK293細胞平鋪于96孔板，將濃縮后的病毒貯存液按不同的稀釋倍數稀釋，加至293細胞培養孔中，于37℃、CO2培養箱中培養10 d，第10天于熒光顯微鏡下觀察并計算每行出現細胞病變效應(CPE)的孔數和陽性孔的比率。按照TCID50法〔5〕的計算公式，對于100 μl樣品，滴度T=101+d(s-0.5)，式中d=log10稀釋度;s=各稀釋度陽性孔的比率之和。將TCID50/ml轉換成 pfu/ml，按以下公式計算:T=a ×10bTCID50/ml=a×10b－0.7pfu/ml。

1.2.6 PSMA蛋白的表達 將HEK293細胞按6×106/ml接種75 cm2培養瓶，細胞密度60% ～80%時，將病毒上清液以感染復數(MOI)200感染細胞，48 h熒光顯微鏡觀察GFP表達〔6〕。同時，用細胞裂解液處理細胞，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入抗PSMA單克隆抗體和羊抗兔二抗分別按1∶2 000和1∶5 000稀釋使用?；瘜W發光法顯色。

2 結果

2.1 pShuttle-GFP-PSMA穿梭質粒的鑒定 分別對重組pShuttle-GFP-PSMA穿梭質粒和空載體pShuttle-CMV-EGFP進行SfiⅠ酶切，PCR擴增鑒定，前者得到約2.2 kb和5.1 kb的兩個條帶，與插入的目的片段大小相一致，見圖1。后者陰性克隆得到5.1 kb一條帶即重組穿梭載體片段。測序鑒定后的結果與GenBank報道一致。

圖1 pShuttle-GFP-PSMA鑒定結果

2.2 重組腺病毒質粒pAdxsi-GFP-PSMA的鑒定 用XhoI酶分別對重組腺病毒質粒pAdxsi-GFP-PSMA和空載體pAdxsi-GFP進行酶切，酶切完成后加樣至1%的瓊脂糖凝膠，電泳，陽性克隆有 7 條帶:14 kb、11.8 kb、4.8 kb、2.66 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb，空載體有 6 條帶:14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb。見圖 2 和圖 3。

圖2 pAdxsi-GFP-PSMA酶切電泳結果

圖3 pAdxsi空載體酶切電泳結果

2.3 重組人PSMA腺病毒的產生及鑒定 用PacⅠ線性化的pAdxsi-GFP-PSMA轉染HEK293細胞，培養1 w后出現細胞呈空泡樣病變，在熒光顯微鏡下見明顯細胞病理效應時，提取病毒DNA，經PCR反應，電泳見2 200 bp大小目的條帶。見圖4。說明目的基因已重組到腺病毒基因組上。將鑒定正確的濃縮病毒液以不同比例稀釋重感染HEK 293細胞，計算病毒滴度為2.0×1010pfu/ml。

2.4 重組腺病毒體外轉染HEK293細胞的Western印跡測定 Ad-PSMA轉染HEK293細胞后，48 h后熒光顯微鏡觀察GFP陽性表達率約達90%。Western印跡顯示，在相對分子質量100 kD有一條帶，與PSMA大小基本相符(糖基化作用使其相對分子質量略大于氨基酸理論值81 kD)，而對照Ad未見PSMA表達條帶。見圖5，圖6。

圖4 重組純化腺病毒PCR電泳圖

圖5 重組腺病毒體外轉染HEK293細胞的Western印跡結果

圖6 Ad-GFP-PSMA轉染HEK293細胞48 h后結果(×100)

3 討論

PSMA是由前列腺上皮細胞分泌的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，含有750個氨基酸，相對分子質量約為100 000。PSMA由3個結構域組成，分別為含19個氨基酸的胞內N-末端區、24個氨基酸的跨膜區和707個氨基酸的胞外區，其胞內區和胞外區有多個表位，可與多種單克隆抗體結合。與表位結合的抗體、特別是與胞外區表位結合的抗體在前列腺癌的診斷和治療中具有重要價值。PSMA在前列腺組織、前列腺癌及其淋巴結轉移灶、骨轉移灶中表達呈陽性，并且僅上皮細胞呈陽性，基質細胞則為陰性;其他組織幾乎無表達〔7，8〕。PSMA在癌組織中表達強度較高，其表達水平與病情進展有明顯相關性，發生轉移、對激素治療不敏感的Gleason評分較高的病例表達水平明顯高于病情穩定的病例〔9〕;而前列腺癌去勢治療后有55%的原發灶PSMA表達增加，繼發灶則100%表達增加。因而可以認為，對于前列腺癌尤其是惡性程度較高、激素治療不敏感和轉移癌，PSMA是一種有效的基因治療靶位〔10，11〕。本文據此構建了含PSMA基因序列的復制缺陷型腺病毒載體。

腺病毒在腫瘤基因治療中有很好的治療效果和應用前景，具有諸多優勢:①腺病毒不僅能高效感染多種增殖細胞，也能感染靜息細胞;②不與細胞的基因組發生整合，不引起基因突變，并可攜帶較大片段的外源基因;③其感染宿主范圍廣，對人致病性低;④感染宿主細胞后表達的目的抗原，較質粒載體易獲得更強的免疫應答〔12〕。因此，腺病毒成為繼逆轉錄病毒后被廣泛應用于基因免疫治療的一種比較理想的表達載體。我們選用Adxsi系統，該系統由穿梭質粒載體系統，病毒骨架載體，及包裝細胞系HEK293構成，其中pAdxsi骨架質粒是攜帶5型腺病毒基因組(去掉了E1區和E3區)，所以該系統構建的腺病毒載體屬于復制缺陷型腺病毒載體。該系統采用直接連接的方案進行穿梭載體與病毒骨架質粒的重組。直接連接的方案采用I-Ceul及I-Scel雙酶切位點定向克隆，采用這兩個酶切位點的好處是識別序列非常長，在人的基因組內幾乎沒有任何這兩個酶切位點。Adxsi系統的最大優勢是病毒包裝穩定，病毒滴度高，可以包裝有細胞毒性的基因，也可以包裝干擾腺病毒生理過程(感染、復制、包裝等過程)的基因。本實驗中，Adxsi系統通過控制PSMA基因在包裝細胞系中表達從而提高了腺病毒包裝的成功率，同時也大大提高了腺病毒的滴度。大量擴增后我們用CsCl純化法，去除有缺陷的病毒顆粒、細胞碎片和少量培養基成分，最大限度的降低這些污染誘導的免疫學反應〔13，14〕，制備出高滴度(2 ×1010pfu/ml)，高產量的攜帶PSMA基因的重組腺病毒。

為了解攜帶人PSMA基因的重組腺病毒能否表達，本研究將包裝的病毒感染HEK293細胞后，通過熒光倒置顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白的表達。以病毒裂解液為模板進行的PCR反應也證實病毒基因組中含有PSMA的基因片段。同時收集轉染后的HEK293細胞，進行Western印跡鑒定，能見大小基本正確的目的蛋白條帶。我們成功地制備了表達人類PSMA基因的重組腺病毒，這一初步結果為進一步研究用其制備樹突細胞疫苗治療前列腺癌打下基礎。

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