人前列腺特異性膜抗原基因重組腺病毒的構(gòu)建及其表達

楊明花 王 帥 田 昕 李 妍 隋承光 (中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤研究所，遼寧 沈陽 110001)

前列腺癌在歐美國家是最常見的男性惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，2008年美國有28 660人死于前列腺癌，同時有186 320例新增病例〔1〕，我國前列腺癌發(fā)病率也呈明顯上升的趨勢，尤其在老年男性人群中發(fā)病率較高〔2〕。前列腺特異膜抗原(PSMA)是一種較前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)更加敏感和特異的前列腺癌(PCa)腫瘤標記物，已成為前列腺癌研究中的熱點之一〔3〕。PSMA是存在于前列腺腺上皮細胞胞膜的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在前列腺癌基因治療中具有良好的靶向性〔4〕。重組復(fù)制缺陷型腺病毒作為基因治療和蛋白表達載體，已成為基因免疫治療研究中最為廣泛的載體之一。本實驗通過腺病毒 Adxsi系統(tǒng)構(gòu)建一種能高效表達人類PSMA基因的重組腺病毒，為下一步研究用其制備樹突細胞疫苗治療前列腺癌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pCMV-SPORT6/PSMA質(zhì)粒、pShuttle-CMV-EGFP穿梭質(zhì)粒和pAdxsi腺病毒骨架質(zhì)粒均由本室保存，所用限制性內(nèi)切酶均購自New England Biolabs公司;T4 DNA連接酶購自晶美生物公司;CIP(Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal)酶購自promega公司;pfx DNA聚合酶購自Invitrogen公司;dNTP購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;引物合成于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒(柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒 (柱離心型)均購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司;1 kb DNA ladder購自鼎國生物公司;DNA Marker DL2000為大連寶生物的TAKARA產(chǎn)品，兔抗人PSMA單克隆抗體購自Epitomics公司;羊抗兔二抗購自中杉公司;兔抗人β-actin多克隆抗體購自康為世紀公司。大腸桿菌DH5α超級化學(xué)感受態(tài)，HEK293細胞由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 PSMA基因片段的克隆 參照PSMA序列設(shè)計一對上下游中均含有SfiⅠ酶切位點的引物，以pCMV-SPORT6/PSMA為模板，高保真酶(pfx DNA ploymerase)進行 PCR擴增，獲得PSMA基因片段。

1.2.2 pShuttle-GFP-PSMA穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將回收后的PSMA基因片段和腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-EGFP均用SfiⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，柱離心型DNA純化試劑盒回收獲得的約2.2 kb的PSMA基因片段和5.1 kb的載體DNA片段。以分子濃度比為3∶1比例，將回收后的PSMA基因與載體DNA片段用T4 DNA連接酶，于22℃下連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，接種卡那霉素平板培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆擴增培養(yǎng)，質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒純化質(zhì)粒，獲得重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-PSMA。分別對重組pShuttle-GFP-PSMA穿梭質(zhì)粒和空載體pShuttle-CMV-EGFP進行SfiⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定有無PSMA基因片段。為確保重組質(zhì)粒pShuttle-GFP-PSMA中插入序列及讀碼框架的正確性，送交上海生工進行測序鑒定。

1.2.3 重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA的構(gòu)建及鑒定 用I-CeuI和I-SceI雙酶切處理穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-PSMA，跑膠回收含目的基因的片段，同時用I-CeuI和I-SceI雙酶切處理pAdxsi載體，并做CIP去磷酸化處理，乙醇沉淀法回收載體，將處理好的載體片段和插入片段用T4 DNA連接酶進行連接，取3 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細胞DH5α菌株，涂布到氨芐抗性固體培養(yǎng)基平皿，挑取若干陽性克隆菌落，接種到氨芐抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒純化質(zhì)粒，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA。同法制備不含目的基因的對照重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP。用XhoI酶分別對重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA和空載體pAdxsi-GFP進行酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建是否正確。

1.2.4 重組人PSMA腺病毒的包裝、擴增及純化 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293細胞，待細胞融合至80% ～90%時轉(zhuǎn)染重組腺病毒。將鑒定正確的攜帶PSMA基因的腺病毒質(zhì)粒用PacI限制性內(nèi)切酶線性化，Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293包裝細胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，7～12 d后可觀察到細胞病變效應(yīng)(CPE)，并可在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達，收集細胞，離心后棄上清，用1 ml PBS重懸細胞，－80℃、37℃反復(fù)凍融3次，離心，收集病毒上清液。取40% ～50%上清液重新感染80%～90%的HEK 293細胞，以相同的方法反復(fù)凍融4次，收上清液，用CsCl密度梯度離心法純化病毒，分裝成小份，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 重組腺病毒質(zhì)粒的提取鑒定及滴度測定 取重組病毒上清 10 μl，加 2 μl蛋白酶 K(10 mg/ml)，50℃孵育 1 h，100 ℃煮沸5 min，離心后取上清2 μl做模板，PCR鑒定重組病毒。將HEK293細胞平鋪于96孔板，將濃縮后的病毒貯存液按不同的稀釋倍數(shù)稀釋，加至293細胞培養(yǎng)孔中，于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，第10天于熒光顯微鏡下觀察并計算每行出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)(CPE)的孔數(shù)和陽性孔的比率。按照TCID50法〔5〕的計算公式，對于100 μl樣品，滴度T=101+d(s-0.5)，式中d=log10稀釋度;s=各稀釋度陽性孔的比率之和。將TCID50/ml轉(zhuǎn)換成 pfu/ml，按以下公式計算:T=a ×10bTCID50/ml=a×10b－0.7pfu/ml。

1.2.6 PSMA蛋白的表達 將HEK293細胞按6×106/ml接種75 cm2培養(yǎng)瓶，細胞密度60% ～80%時，將病毒上清液以感染復(fù)數(shù)(MOI)200感染細胞，48 h熒光顯微鏡觀察GFP表達〔6〕。同時，用細胞裂解液處理細胞，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入抗PSMA單克隆抗體和羊抗兔二抗分別按1∶2 000和1∶5 000稀釋使用。化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié)果

2.1 pShuttle-GFP-PSMA穿梭質(zhì)粒的鑒定 分別對重組pShuttle-GFP-PSMA穿梭質(zhì)粒和空載體pShuttle-CMV-EGFP進行SfiⅠ酶切，PCR擴增鑒定，前者得到約2.2 kb和5.1 kb的兩個條帶，與插入的目的片段大小相一致，見圖1。后者陰性克隆得到5.1 kb一條帶即重組穿梭載體片段。測序鑒定后的結(jié)果與GenBank報道一致。

圖1 pShuttle-GFP-PSMA鑒定結(jié)果

2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA的鑒定 用XhoI酶分別對重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA和空載體pAdxsi-GFP進行酶切，酶切完成后加樣至1%的瓊脂糖凝膠，電泳，陽性克隆有 7 條帶:14 kb、11.8 kb、4.8 kb、2.66 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb，空載體有 6 條帶:14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb。見圖 2 和圖 3。

圖2 pAdxsi-GFP-PSMA酶切電泳結(jié)果

圖3 pAdxsi空載體酶切電泳結(jié)果

2.3 重組人PSMA腺病毒的產(chǎn)生及鑒定 用PacⅠ線性化的pAdxsi-GFP-PSMA轉(zhuǎn)染HEK293細胞，培養(yǎng)1 w后出現(xiàn)細胞呈空泡樣病變，在熒光顯微鏡下見明顯細胞病理效應(yīng)時，提取病毒DNA，經(jīng)PCR反應(yīng)，電泳見2 200 bp大小目的條帶。見圖4。說明目的基因已重組到腺病毒基因組上。將鑒定正確的濃縮病毒液以不同比例稀釋重感染HEK 293細胞，計算病毒滴度為2.0×1010pfu/ml。

2.4 重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染HEK293細胞的Western印跡測定 Ad-PSMA轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，48 h后熒光顯微鏡觀察GFP陽性表達率約達90%。Western印跡顯示，在相對分子質(zhì)量100 kD有一條帶，與PSMA大小基本相符(糖基化作用使其相對分子質(zhì)量略大于氨基酸理論值81 kD)，而對照Ad未見PSMA表達條帶。見圖5，圖6。

圖4 重組純化腺病毒PCR電泳圖

圖5 重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染HEK293細胞的Western印跡結(jié)果

圖6 Ad-GFP-PSMA轉(zhuǎn)染HEK293細胞48 h后結(jié)果(×100)

3 討論

PSMA是由前列腺上皮細胞分泌的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，含有750個氨基酸，相對分子質(zhì)量約為100 000。PSMA由3個結(jié)構(gòu)域組成，分別為含19個氨基酸的胞內(nèi)N-末端區(qū)、24個氨基酸的跨膜區(qū)和707個氨基酸的胞外區(qū)，其胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)有多個表位，可與多種單克隆抗體結(jié)合。與表位結(jié)合的抗體、特別是與胞外區(qū)表位結(jié)合的抗體在前列腺癌的診斷和治療中具有重要價值。PSMA在前列腺組織、前列腺癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、骨轉(zhuǎn)移灶中表達呈陽性，并且僅上皮細胞呈陽性，基質(zhì)細胞則為陰性;其他組織幾乎無表達〔7，8〕。PSMA在癌組織中表達強度較高，其表達水平與病情進展有明顯相關(guān)性，發(fā)生轉(zhuǎn)移、對激素治療不敏感的Gleason評分較高的病例表達水平明顯高于病情穩(wěn)定的病例〔9〕;而前列腺癌去勢治療后有55%的原發(fā)灶PSMA表達增加，繼發(fā)灶則100%表達增加。因而可以認為，對于前列腺癌尤其是惡性程度較高、激素治療不敏感和轉(zhuǎn)移癌，PSMA是一種有效的基因治療靶位〔10，11〕。本文據(jù)此構(gòu)建了含PSMA基因序列的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。

腺病毒在腫瘤基因治療中有很好的治療效果和應(yīng)用前景，具有諸多優(yōu)勢:①腺病毒不僅能高效感染多種增殖細胞，也能感染靜息細胞;②不與細胞的基因組發(fā)生整合，不引起基因突變，并可攜帶較大片段的外源基因;③其感染宿主范圍廣，對人致病性低;④感染宿主細胞后表達的目的抗原，較質(zhì)粒載體易獲得更強的免疫應(yīng)答〔12〕。因此，腺病毒成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒后被廣泛應(yīng)用于基因免疫治療的一種比較理想的表達載體。我們選用Adxsi系統(tǒng)，該系統(tǒng)由穿梭質(zhì)粒載體系統(tǒng)，病毒骨架載體，及包裝細胞系HEK293構(gòu)成，其中pAdxsi骨架質(zhì)粒是攜帶5型腺病毒基因組(去掉了E1區(qū)和E3區(qū))，所以該系統(tǒng)構(gòu)建的腺病毒載體屬于復(fù)制缺陷型腺病毒載體。該系統(tǒng)采用直接連接的方案進行穿梭載體與病毒骨架質(zhì)粒的重組。直接連接的方案采用I-Ceul及I-Scel雙酶切位點定向克隆，采用這兩個酶切位點的好處是識別序列非常長，在人的基因組內(nèi)幾乎沒有任何這兩個酶切位點。Adxsi系統(tǒng)的最大優(yōu)勢是病毒包裝穩(wěn)定，病毒滴度高，可以包裝有細胞毒性的基因，也可以包裝干擾腺病毒生理過程(感染、復(fù)制、包裝等過程)的基因。本實驗中，Adxsi系統(tǒng)通過控制PSMA基因在包裝細胞系中表達從而提高了腺病毒包裝的成功率，同時也大大提高了腺病毒的滴度。大量擴增后我們用CsCl純化法，去除有缺陷的病毒顆粒、細胞碎片和少量培養(yǎng)基成分，最大限度的降低這些污染誘導(dǎo)的免疫學(xué)反應(yīng)〔13，14〕，制備出高滴度(2 ×1010pfu/ml)，高產(chǎn)量的攜帶PSMA基因的重組腺病毒。

為了解攜帶人PSMA基因的重組腺病毒能否表達，本研究將包裝的病毒感染HEK293細胞后，通過熒光倒置顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白的表達。以病毒裂解液為模板進行的PCR反應(yīng)也證實病毒基因組中含有PSMA的基因片段。同時收集轉(zhuǎn)染后的HEK293細胞，進行Western印跡鑒定，能見大小基本正確的目的蛋白條帶。我們成功地制備了表達人類PSMA基因的重組腺病毒，這一初步結(jié)果為進一步研究用其制備樹突細胞疫苗治療前列腺癌打下基礎(chǔ)。

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