芍藥苷對脂肪組織釋放游離脂肪酸及抗氧化作用的影響

劉雨娟 黃 征 藺美玲 張小郁 鄭天珍

(蘭州大學基礎醫學院生理學與心理學研究所，甘肅 蘭州 730000)

肥胖病的機制主要與人的氣血多少，痰濁以及淤血有關。芍藥能養血活血，柔肝止痛，斂陰收汗，屬于滋陰藥。芍藥苷是從芍藥中提取的最主要的生物活性成分。現代醫學認為芍藥苷具有多種藥理活性，如解痙、鎮痛、鎮靜及改善學習記憶的作用，還具有抗自由基損傷，抑制細胞內鈣超載和抗KA神經毒性等多種生物學效果〔1〕。我們的前期工作已證明白芍水煎劑能顯著抑制去卵巢肥胖大鼠的體重和血清甘油三酯(TG)水平的升高，同時可以改善大鼠體內脂代謝紊亂，清除過多的自由基，提高機體的抗氧化能力。但其化學成分芍藥苷是否對脂肪組織有直接的影響，目前國內外尚未見報道。本實驗觀察其對離體脂肪組織釋放游離脂肪酸(FFA)及抗氧化作用的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年SD大鼠，體重(250±20)g。由蘭州大學醫學實驗中心提供，動物等級為清潔級。芍藥苷由陜西旭煌植物科技發展有限公司提供。異搏定為蘭州制藥廠產品。普萘洛爾(心得安)為北京第二制藥廠產品。AC抑制劑(SQ22，536)和小牛血清白蛋白(BSA)由Sigma公司提供。鹽酸腎上腺素為天津金耀氨基酸公司產品。丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)檢測的試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法 將SD大鼠脫臼處死，迅速剪取腹膜后脂肪組織塊，每份(50±2.0)mg，放入37℃的含有0.04 g/ml小牛血清白蛋白的Krebs液中溫育。溫育液中可分別加入不同濃度的芍藥苷及不同的阻斷劑，加入的藥物容量均為20 μl。溫育過程中持續通入95%的O2和5%CO2的混合氣體。90 min后，吸取溫育液用一次提取比色法測定FFA的含量。用化學反應法檢測MDA及T-AOC，檢測方法均嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3 實驗分組 實驗分為8組，分別為:①正常對照組(0.9%NaCl);②鹽酸腎上腺素(10-6mol/L)組;③芍藥苷低劑量(10－7mol/L)組;④芍藥苷中劑量(10－6mol/L)組;⑤芍藥苷高劑量(10－5mol/L)組;⑥心得安(10－5mol/L)+芍藥苷(106mol/L)組;⑦ SQ22，536(10－5mol/L)+ 芍 藥 苷(106mol/L)組;⑧維拉帕米(異搏定)(10－5mol/L)+芍藥苷(10－6mol/L)組。

1.4 統計學處理 SPSS11.5軟件處理實驗數據，用表示，組間顯著性差異采用單因素方差分析法。

2 結果

2.1 芍藥苷對脂肪組織釋放FFA的影響 與正常對照組相比〔(34.75±2.14)μmol/L〕，鹽酸腎上腺素可明顯促進脂肪組織釋放FFA〔(192.74±18.43)μmol/L，P＜0.001)〕。低濃度芍藥苷(10－7mol/L)對脂肪組織釋放FFA無明顯的促進作用〔(36.60 ± 2.87)μmol/L〕。中、高濃度的芍藥苷 (10－6，10－5mol/L)可分別促進脂肪組織釋放 FFA〔(44.58±2.02)μmol/L，(54.21 ±2.81)μmol/L，P ＜0.01，P ＜0.001〕，且存在相應的劑量效應關系(r﹦0.839，P＜0.01)。

2.2 阻斷劑對芍藥苷促進脂肪組織釋放FFA的影響 芍藥苷(10－6mol/L)分別和心得安(10－5mol/L)、SQ22，536(10－5mol/L)、異搏定(10－5mol/L)共同溫育時，可分別降低芍藥苷促進脂肪組織釋放FFA的作用(54.21±2.81，37.91±2.13，36.57±1.56，36.81 ±1.38)，與濃度 10－6mol/L 的芍藥苷組相比P＜0.05和P＜0.01。

2.3 芍藥苷及阻斷劑加芍藥苷對脂肪組織中MDA和T-AOC的影響 與正常對照組相比，鹽酸腎上腺素和芍藥苷可顯著降低脂肪組織中MDA的含量(P均＜0.001);明顯增高T-AOC水平(P ＜ 0.001，P ＜ 0.01)。心得安(10－6mol/L)、SQ22，536(10－6mol/L)、異搏定 (10－6mol/L)分別和芍藥苷(10－6mol/L)共同溫育時，其降低MDA、提高T-AOC的作用可部分被抑制，與濃度為10－6mol/L的芍藥苷組差異顯著(P＜0.001，P ＜0.05，P ＜0.01)。見表1。

表1 芍藥苷及阻斷劑加芍藥苷對離體脂肪組織中MDA和T-AOC的影響(，n=8)

表1 芍藥苷及阻斷劑加芍藥苷對離體脂肪組織中MDA和T-AOC的影響(，n=8)

與正常對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.001;與10－6mol/L芍藥苷組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01，5)P ＜0.001

組別MDA(nmol/ml)T-AOC(IU/ml)8.76±0.34 0.54±0.15鹽酸腎上腺素(10－6mol/L) 7.48±0.742)0.88±0.172)芍藥苷(10－6mol/L) 3.94±0.312)0.74±0.151)心得安(10－5mol/L)+芍藥苷(10－6mol/L) 5.65±0.435)0.57±0.093)SQ22，536(10－5mol/L)+ 芍藥苷(10－6mol/L)5.74±0.545)0.54±0.114)異搏定(10－5mol/L)+ 芍藥苷(10－6mol/L)5.76±0.595)0.59±0.113)正常對照(0.9%NaCl)

3 討論

FFA是貯存于脂肪細胞中的TG在激素敏感脂肪酶(HLS)的催化作用下水解生成。研究發現激素敏感脂肪酶還可能是TG水解的限速酶。在離體的脂肪組織中，脂肪動員過程主要由信號轉導途徑調控。在嚙齒類動物中 β3腎上腺素受體(β3AR)主要分布于白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)中。β3腎上腺素受體主要調節機體的脂肪分解和產熱過程，β3AR激動劑通過刺激白色脂肪組織的脂解作用和棕色脂肪組織的非粟性產熱，消耗貯脂，起到抗肥胖作用〔2〕。β3AR屬于G蛋白偶聯受體超家族，G蛋白貫通膜7次，并通過配體與受體結合，激活脂肪細胞內腺苷酸環化酶，增強環磷酰胺激活蛋白磷酸激酶A(PKA)的功效，PKA通過激活激素敏感性脂肪酶的磷酸化過程，活化激素敏感性脂肪酶，使TG分解生成FFA和甘油。大鼠脂肪細胞內存在的脂被蛋白能被蛋白激酶A磷酸化〔3〕。未磷酸化的脂被蛋白可能在脂滴表面形成一種“屏障”，阻止激素敏感性脂肪酶接觸到脂滴內的TG，從而抑制脂肪分解，腎上腺素與脂肪細胞上β3AR結合后，激活cAMPPKA信號轉導系統，引起脂被蛋白和激素敏感性脂酶同步磷酸化，進而導致TG水解。本實驗結果發現用鹽酸腎上腺素作用于脂肪組織時，可非常顯著的促進FFA的釋放，與上述理論是一致的。另外，本實驗還發現芍藥苷也可促進離體脂肪組織分解釋放FFA，且存在相應的劑量效應關系;同時還能降低MDA含量，升高T-AOC水平。非選擇性β腎上腺素受體阻斷劑心得安和AC抑制劑(SQ22，536)可部分阻斷芍藥苷促進離體脂肪組織釋放FFA，降低MDA含量，升高總抗水平的作用，據此可推測芍藥苷的上述作用可能部分經由 β3AR，進而抑制cAMP-PKA信號轉導途徑來發揮作用。

細胞內鈣離子的改變是細胞生理活動的重要物質基礎，鈣離子作為肌醇磷酯代謝途徑中重要的第二信使在細胞內信號傳導以及誘發一系列細胞功能事件中起重要作用。細胞內Ca2+來源于細胞外液Ca2+內流和細胞內鈣庫Ca2+釋放(主要是肌質網，SR)。大量的證據表明，胞外Ca2+內流起決定性作用，Ca2+內流亦可激發細胞內鈣庫中Ca2+釋放。L型鈣通道是胞外Ca2+內流的主要通道。Ca2+信號通過參與環磷腺苷(cAMP)和磷脂酰二磷酸肌醇(PIP2)通路的級聯反應，調節一些酶的活性〔4〕，即激活激素敏感性脂肪酶，進而促進TG水解生成FFA。異搏定可能會破壞細胞內的鈣穩態，改變細胞對各種受體介導信號反應的能力〔5〕。有報道赤芍總苷能明顯提高細胞內Ca2+濃度〔6〕。本實驗選用L型鈣通道阻斷劑異搏定后，抑制了芍藥苷促進離體脂肪組織釋放FFA、降低MDA、升高T-AOC的作用，且芍藥苷是赤芍總苷的主要化學成分，因此推測芍藥苷的作用可能部分經L型鈣通道起作用。

肥胖時血脂升高，脂質過氧化可使自由基產生增多及解偶聯蛋白水平下降。MDA是脂質過氧化的終末反應產物之一。過多的脂質過氧化物可消耗細胞內谷胱甘肽和維生素E，導致機體酶促及非酶促防御體系的T-AOC減弱〔7〕。在本實驗中，鹽酸腎上腺素在促進脂肪組織釋放FFA的同時，可降低MDA含量升高T-AOC。芍藥苷亦具有此作用。說明芍藥苷可清除脂肪組織過多的自由基，提高T-AOC。有研究發現腎上腺素是內源性的抗氧化劑，但同時又具有促氧化作用。芍藥苷是否有促氧化作用，及促進FFA釋放與其抗氧化能力之間是否存在因果關系尚需進一步探討。

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